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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 核酸杂交 » 目的片段和载体连接一直不上
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赵晓楠zxn

金虫 (初入文坛)
送红花一朵
引用回帖:
17楼: Originally posted by lingsheshidu at 2014-04-14 21:45:44
那就是酶切效率的问题了，可能保护碱基加的少或者不合适，因为PCR产物直接酶切构建载体确实不如先连接T载体容易，原因就是如果保护碱基加的少酶切效率还是较低的。如果你认为保护碱基加的没问题，而且酶切以后也经 ...

我也不确定目的片段是否酶切开，片段738bp，切开也只是少了几个碱基，电泳看不出来。用的是promrga的T4连接酶。
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在学术的汪洋里，扑腾。
21楼2014-04-15 12:21:39
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Fleaves

至尊木虫 (著名写手)
老老实实先把目的片段连接到T载体上在酶切吧，这样做不出来起码可以知道哪里的问题
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22楼2014-04-15 19:16:33
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owl2010

金虫 (正式写手)
引用回帖:
20楼: Originally posted by 赵晓楠zxn at 2014-04-15 10:58:23
我的载体回收浓度为6.6ng/ul，目的片段浓度为8.2ng/ul，用的20ul 反应体系，载体加10ul，目的片段加4ul。   
如果按你所说的质粒回收浓度在30ng/ul ，片段10ng/ul ，你是用多大的反应体系呢，载体和片段各加多少u ...

这两个都可以控制。有个简单的公式可以算  片段需要加的浓度为=（片段大小/载体片段大小）X摩尔比（3到10 推荐到10）X载体的浓度
比如，我片段500bp，载体5000bp，质粒浓度30ng。我可以加1ul 2ui 3ul 都没有问题 片段在这个体系里的浓度为 (500/5000)X10(一般我都是10)X30（60 90 ）=30ng（60 90 ） 那么，片段浓度时10ng的话，如果我载体加1ul 片段就得加3ul 载体加2ul，片段就得加6ul 依次类推，你可以这样计算一下 我一般都是10ul体系。
如果你这样子都连不上的话，你老板要是有钱的话，推荐你买一个重组试剂盒，很便宜的，大概只要600快，可以做40次左右，只是这个是需要知道载体的序列，就是多克隆位点上下100bp左右就可以了
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男人的组成要素:金钱、面子、性、怕死、自恋、吹牛逼。
23楼2014-04-26 16:11:33
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owl2010

金虫 (正式写手)
引用回帖:
23楼: Originally posted by owl2010 at 2014-04-26 16:11:33
这两个都可以控制。有个简单的公式可以算  片段需要加的浓度为=（片段大小/载体片段大小）X摩尔比（3到10 推荐到10）X载体的浓度
比如，我片段500bp，载体5000bp，质粒浓度30ng。我可以加1ul 2ui 3ul 都没有问题  ...

如果你已经引物上加了保护碱基并且正确的话，建议连接到PMD-simple载体上，其他的PMD系列载体上会和你的酶切位点重合，为确保酶切完全的话还是连接到没有任何酶切位点的载体上为好，再去检测下酶是不是有问题。
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男人的组成要素:金钱、面子、性、怕死、自恋、吹牛逼。
24楼2014-04-26 16:16:36
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kingjazz23

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by for5 at 2014-04-12 20:57:42
没长菌算是坏事中的好事，至少没有假阳性，那就调整比例多连几次吧。继续转。
T载体那是因为连接效率高，需要用taq酶进行PCR，是目的基因两端加A，但是同时质量不好的T载体容易形成自连，也就导致假阳性

没长菌这个问题主要是因为载体和目的片段的比例问题吗,我最近做连接转化，一直都不长菌，不知道是什么原因
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25楼2016-05-24 21:16:20
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