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目的片段和载体连接一直不上已有7人参与
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1、目的片段738bp（两端带酶切位点）,载体选择pCAMBIA3301,酶切位点选择Nco I和BstE II。载体确定已经双酶切开来，目的片段应该也双酶切成功（电泳图片看不出来）。用的Promega的T4连接酶，载体和目的片段摩尔比1:5，反应体系20ul，22℃连接3.5小时，转化至DH5α，未出现菌落。 2、也有说将目的片段和T载体先连接，然后再和表达载体连接，这样更容易连上。原理是什么，不懂。 感谢您的帮助。 |
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owl2010
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这两个都可以控制。有个简单的公式可以算 片段需要加的浓度为=（片段大小/载体片段大小）X摩尔比（3到10 推荐到10）X载体的浓度 比如，我片段500bp，载体5000bp，质粒浓度30ng。我可以加1ul 2ui 3ul 都没有问题 片段在这个体系里的浓度为 (500/5000)X10(一般我都是10)X30（60 90 ）=30ng（60 90 ） 那么，片段浓度时10ng的话，如果我载体加1ul 片段就得加3ul 载体加2ul，片段就得加6ul 依次类推，你可以这样计算一下 我一般都是10ul体系。 如果你这样子都连不上的话，你老板要是有钱的话，推荐你买一个重组试剂盒，很便宜的，大概只要600快，可以做40次左右，只是这个是需要知道载体的序列，就是多克隆位点上下100bp左右就可以了 |
23楼2014-04-26 16:11:33
for5
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3楼2014-04-12 22:46:37
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4楼2014-04-12 23:06:33