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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 核酸杂交 » 目的片段和载体连接一直不上
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赵晓楠zxn

金虫 (初入文坛)

[求助] 目的片段和载体连接一直不上 已有7人参与

1、目的片段738bp（两端带酶切位点）,载体选择pCAMBIA3301,酶切位点选择Nco I和BstE II。载体确定已经双酶切开来，目的片段应该也双酶切成功（电泳图片看不出来）。用的Promega的T4连接酶，载体和目的片段摩尔比1:5，反应体系20ul，22℃连接3.5小时，转化至DH5α，未出现菌落。
2、也有说将目的片段和T载体先连接，然后再和表达载体连接，这样更容易连上。原理是什么，不懂。
感谢您的帮助。
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在学术的汪洋里，扑腾。
1楼 2014-04-12 20:46:55
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owl2010

金虫 (正式写手)
胶回收浓度太低啦，质粒建议回收浓度在30ng/ul 片段10ng/ul 应该可以了，一般都是过夜连接的。你是直接用PCR引物加酶切位点直接扩增做酶切吗？要确定酶切位点上有保护碱基，如果没有的话只能连到T载体上了。
现在有些公司有一种重组试剂盒卖，不贵，基本上和TAKARA的T载体价格一样，利用重组很快的。
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赵晓楠zxn
男人的组成要素:金钱、面子、性、怕死、自恋、吹牛逼。
11楼2014-04-14 16:22:51
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owl2010

金虫 (正式写手)
引用回帖:
20楼: Originally posted by 赵晓楠zxn at 2014-04-15 10:58:23
我的载体回收浓度为6.6ng/ul，目的片段浓度为8.2ng/ul，用的20ul 反应体系，载体加10ul，目的片段加4ul。   
如果按你所说的质粒回收浓度在30ng/ul ，片段10ng/ul ，你是用多大的反应体系呢，载体和片段各加多少u ...

这两个都可以控制。有个简单的公式可以算  片段需要加的浓度为=（片段大小/载体片段大小）X摩尔比（3到10 推荐到10）X载体的浓度
比如，我片段500bp，载体5000bp，质粒浓度30ng。我可以加1ul 2ui 3ul 都没有问题 片段在这个体系里的浓度为 (500/5000)X10(一般我都是10)X30（60 90 ）=30ng（60 90 ） 那么，片段浓度时10ng的话，如果我载体加1ul 片段就得加3ul 载体加2ul，片段就得加6ul 依次类推，你可以这样计算一下 我一般都是10ul体系。
如果你这样子都连不上的话，你老板要是有钱的话，推荐你买一个重组试剂盒，很便宜的，大概只要600快，可以做40次左右，只是这个是需要知道载体的序列，就是多克隆位点上下100bp左右就可以了
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男人的组成要素:金钱、面子、性、怕死、自恋、吹牛逼。
23楼2014-04-26 16:11:33
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owl2010

金虫 (正式写手)
引用回帖:
23楼: Originally posted by owl2010 at 2014-04-26 16:11:33
这两个都可以控制。有个简单的公式可以算  片段需要加的浓度为=（片段大小/载体片段大小）X摩尔比（3到10 推荐到10）X载体的浓度
比如，我片段500bp，载体5000bp，质粒浓度30ng。我可以加1ul 2ui 3ul 都没有问题  ...

如果你已经引物上加了保护碱基并且正确的话，建议连接到PMD-simple载体上，其他的PMD系列载体上会和你的酶切位点重合，为确保酶切完全的话还是连接到没有任何酶切位点的载体上为好，再去检测下酶是不是有问题。
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男人的组成要素:金钱、面子、性、怕死、自恋、吹牛逼。
24楼2014-04-26 16:16:36
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