24小时热门版块排行榜    

CyRhmU.jpeg
查看: 4755  |  回复: 24

owl2010

金虫 (正式写手)

胶回收浓度太低啦,质粒建议回收浓度在30ng/ul 片段10ng/ul 应该可以了,一般都是过夜连接的。你是直接用PCR引物加酶切位点直接扩增做酶切吗?要确定酶切位点上有保护碱基,如果没有的话只能连到T载体上了。
现在有些公司有一种重组试剂盒卖,不贵,基本上和TAKARA的T载体价格一样,利用重组很快的。

» 本帖已获得的红花(最新10朵)

男人的组成要素:金钱、面子、性、怕死、自恋、吹牛逼。
11楼2014-04-14 16:22:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
试下16度过夜看看。
12楼2014-04-14 17:07:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

赵晓楠zxn

金虫 (初入文坛)

引用回帖:
12楼: Originally posted by 鬼羽帝魂 at 2014-04-14 17:07:31
试下16度过夜看看。

试过,也不行。
在学术的汪洋里,扑腾。
13楼2014-04-14 21:20:26
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

赵晓楠zxn

金虫 (初入文坛)

引用回帖:
7楼: Originally posted by lingsheshidu at 2014-04-13 02:27:30
载体构建连接不上,许多时候是载体片段和目的基因片段有问题,既然你给出了mol比例,说明你对于载体片段和目的基因片段的量是经过测算的,因此问题可能出在酶切/连接环节。你的基因片段是否酶切开了呢?这个问题是与 ...

保护碱基加过了。
在学术的汪洋里,扑腾。
14楼2014-04-14 21:27:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

赵晓楠zxn

金虫 (初入文坛)

引用回帖:
8楼: Originally posted by 872940890 at 2014-04-14 14:04:01
我现在也是在做表达  
不知道 双酶切 电泳后 你又切胶回收了吗?
有时候  双酶切后电泳会发现  条带弥散  表明DNA已经被降解了

是的,双酶切电泳后又回收了。
在学术的汪洋里,扑腾。
15楼2014-04-14 21:29:26
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

赵晓楠zxn

金虫 (初入文坛)

引用回帖:
10楼: Originally posted by zhangtao110 at 2014-04-14 15:20:11
如果酶切位点刚好甲基化可能也切不开!

怎么判断酶切位点甲基化?
在学术的汪洋里,扑腾。
16楼2014-04-14 21:30:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lingsheshidu

金虫 (小有名气)

引用回帖:
14楼: Originally posted by 赵晓楠zxn at 2014-04-14 21:27:58
保护碱基加过了。...

那就是酶切效率的问题了,可能保护碱基加的少或者不合适,因为PCR产物直接酶切构建载体确实不如先连接T载体容易,原因就是如果保护碱基加的少酶切效率还是较低的。如果你认为保护碱基加的没问题,而且酶切以后也经过电泳检测了,那么,你用的是Takara的连接酶吗?如果是,强烈建议换成NEB的T4连接酶,两者的连接效率不是一个等级的!我之前也用过Takara的连接酶,后来换成NEB的,就知道前者的差距了。

» 本帖已获得的红花(最新10朵)

积累知识,抓紧奋斗!
17楼2014-04-14 21:45:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhangtao110

银虫 (小有名气)

引用回帖:
16楼: Originally posted by 赵晓楠zxn at 2014-04-14 21:30:18
怎么判断酶切位点甲基化?...

一般基因工程中的大肠杆菌都是甲基化缺陷的,如果正常大肠杆菌会在CCA/TGG序列的胞嘧啶残基甲基化,这样在细胞内就不会被切断了!?而外侵者就会被降解了!所以看你的大肠杆菌和酶切位点了!

[ 发自小木虫客户端 ]
18楼2014-04-14 22:49:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

夏末忆雪

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 应助指数+1, 鼓励回帖交流 2014-04-15 11:06:50
1、凝胶回收后损失过多,导致浓度太低,可以增加质粒和pcr的量,体系中少添加水。2、酶切时间短,pcr产物酶切不完全,加长时间,现在的酶特异性挺好的,一般不会乱切,我一般都是切4h。3、连接时间太短,我之前也是室温连了2h,没长,后来16度过夜,就长出来了。
19楼2014-04-15 09:21:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

赵晓楠zxn

金虫 (初入文坛)

送红花一朵
引用回帖:
11楼: Originally posted by owl2010 at 2014-04-14 16:22:51
胶回收浓度太低啦,质粒建议回收浓度在30ng/ul 片段10ng/ul 应该可以了,一般都是过夜连接的。你是直接用PCR引物加酶切位点直接扩增做酶切吗?要确定酶切位点上有保护碱基,如果没有的话只能连到T载体上了。
现在有 ...

我的载体回收浓度为6.6ng/ul,目的片段浓度为8.2ng/ul,用的20ul 反应体系,载体加10ul,目的片段加4ul。   
如果按你所说的质粒回收浓度在30ng/ul ,片段10ng/ul ,你是用多大的反应体系呢,载体和片段各加多少ul 呢?
在学术的汪洋里,扑腾。
20楼2014-04-15 10:58:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 赵晓楠zxn 的主题更新
信息提示
请填处理意见