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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 核酸杂交 » 目的片段和载体连接一直不上
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owl2010

金虫 (正式写手)
胶回收浓度太低啦，质粒建议回收浓度在30ng/ul 片段10ng/ul 应该可以了，一般都是过夜连接的。你是直接用PCR引物加酶切位点直接扩增做酶切吗？要确定酶切位点上有保护碱基，如果没有的话只能连到T载体上了。
现在有些公司有一种重组试剂盒卖，不贵，基本上和TAKARA的T载体价格一样，利用重组很快的。
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赵晓楠zxn
男人的组成要素:金钱、面子、性、怕死、自恋、吹牛逼。
11楼2014-04-14 16:22:51
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
试下16度过夜看看。
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12楼2014-04-14 17:07:31
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赵晓楠zxn

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
12楼: Originally posted by 鬼羽帝魂 at 2014-04-14 17:07:31
试下16度过夜看看。

试过，也不行。
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在学术的汪洋里，扑腾。
13楼2014-04-14 21:20:26
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赵晓楠zxn

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by lingsheshidu at 2014-04-13 02:27:30
载体构建连接不上，许多时候是载体片段和目的基因片段有问题，既然你给出了mol比例，说明你对于载体片段和目的基因片段的量是经过测算的，因此问题可能出在酶切/连接环节。你的基因片段是否酶切开了呢？这个问题是与 ...

保护碱基加过了。
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在学术的汪洋里，扑腾。
14楼2014-04-14 21:27:58
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赵晓楠zxn

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 872940890 at 2014-04-14 14:04:01
我现在也是在做表达  
不知道 双酶切 电泳后 你又切胶回收了吗？
有时候  双酶切后电泳会发现  条带弥散  表明DNA已经被降解了

是的，双酶切电泳后又回收了。
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在学术的汪洋里，扑腾。
15楼2014-04-14 21:29:26
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赵晓楠zxn

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
10楼: Originally posted by zhangtao110 at 2014-04-14 15:20:11
如果酶切位点刚好甲基化可能也切不开!

怎么判断酶切位点甲基化？
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在学术的汪洋里，扑腾。
16楼2014-04-14 21:30:18
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lingsheshidu

金虫 (小有名气)
引用回帖:
14楼: Originally posted by 赵晓楠zxn at 2014-04-14 21:27:58
保护碱基加过了。...

那就是酶切效率的问题了，可能保护碱基加的少或者不合适，因为PCR产物直接酶切构建载体确实不如先连接T载体容易，原因就是如果保护碱基加的少酶切效率还是较低的。如果你认为保护碱基加的没问题，而且酶切以后也经过电泳检测了，那么，你用的是Takara的连接酶吗？如果是，强烈建议换成NEB的T4连接酶，两者的连接效率不是一个等级的！我之前也用过Takara的连接酶，后来换成NEB的，就知道前者的差距了。
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» 本帖已获得的红花（最新10朵）

赵晓楠zxn
积累知识，抓紧奋斗！
17楼2014-04-14 21:45:44
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zhangtao110

银虫 (小有名气)
引用回帖:
16楼: Originally posted by 赵晓楠zxn at 2014-04-14 21:30:18
怎么判断酶切位点甲基化？...

一般基因工程中的大肠杆菌都是甲基化缺陷的，如果正常大肠杆菌会在CCA/TGG序列的胞嘧啶残基甲基化，这样在细胞内就不会被切断了！？而外侵者就会被降解了！所以看你的大肠杆菌和酶切位点了！

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18楼2014-04-14 22:49:32
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夏末忆雪

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 应助指数+1, 鼓励回帖交流 2014-04-15 11:06:50
1、凝胶回收后损失过多，导致浓度太低，可以增加质粒和pcr的量，体系中少添加水。2、酶切时间短，pcr产物酶切不完全，加长时间，现在的酶特异性挺好的，一般不会乱切，我一般都是切4h。3、连接时间太短，我之前也是室温连了2h，没长，后来16度过夜，就长出来了。
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19楼2014-04-15 09:21:57
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赵晓楠zxn

金虫 (初入文坛)
送红花一朵
引用回帖:
11楼: Originally posted by owl2010 at 2014-04-14 16:22:51
胶回收浓度太低啦，质粒建议回收浓度在30ng/ul 片段10ng/ul 应该可以了，一般都是过夜连接的。你是直接用PCR引物加酶切位点直接扩增做酶切吗？要确定酶切位点上有保护碱基，如果没有的话只能连到T载体上了。
现在有 ...

我的载体回收浓度为6.6ng/ul，目的片段浓度为8.2ng/ul，用的20ul 反应体系，载体加10ul，目的片段加4ul。   
如果按你所说的质粒回收浓度在30ng/ul ，片段10ng/ul ，你是用多大的反应体系呢，载体和片段各加多少ul 呢？
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在学术的汪洋里，扑腾。
20楼2014-04-15 10:58:23
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