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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 核酸杂交 » 目的片段和载体连接一直不上
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赵晓楠zxn

金虫 (初入文坛)

[求助] 目的片段和载体连接一直不上 已有7人参与

1、目的片段738bp（两端带酶切位点）,载体选择pCAMBIA3301,酶切位点选择Nco I和BstE II。载体确定已经双酶切开来，目的片段应该也双酶切成功（电泳图片看不出来）。用的Promega的T4连接酶，载体和目的片段摩尔比1:5，反应体系20ul，22℃连接3.5小时，转化至DH5α，未出现菌落。
2、也有说将目的片段和T载体先连接，然后再和表达载体连接，这样更容易连上。原理是什么，不懂。
感谢您的帮助。
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在学术的汪洋里，扑腾。
1楼 2014-04-12 20:46:55
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夏末忆雪

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 应助指数+1, 鼓励回帖交流 2014-04-15 11:06:50
1、凝胶回收后损失过多，导致浓度太低，可以增加质粒和pcr的量，体系中少添加水。2、酶切时间短，pcr产物酶切不完全，加长时间，现在的酶特异性挺好的，一般不会乱切，我一般都是切4h。3、连接时间太短，我之前也是室温连了2h，没长，后来16度过夜，就长出来了。
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19楼2014-04-15 09:21:57
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