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目的片段载体片段连接不长菌 已有5人参与
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求助： 目前在做连接反应，目的片段3.7kb，载体片段5.5kb，均为双酶切后胶回收获得，将目的片段和载体片段进行连接，连接体系25ul(目的片段10ul，载体6ul，10*T4ligase buffer 2.5ul ,T4 ligase1ul)用的TAKALA家的T4连接酶试剂盒，16度连接过夜，化学转化，图板，均不长菌。做了阳性对照证明感受态和平板都是没有问题的，但为什么连接不长菌的，一个都不长，求各位大侠相助！帮帮忙吧 |
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ninglihua12楼2014-07-22 10:53:26
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2楼2014-07-18 10:33:04
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【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖交流！ 2014-07-18 15:33:40
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连接体系25ul(目的片段10ul，载体6ul，10*T4ligase buffer 2.5ul ,T4 ligase1ul。。。 这个太大了吧。 你试试这个： 载体：19.8X载体大小/（1000X载体浓度）ul 片段：99X片段大小/（1000X片段浓度）ul T4酶： 1ul 10XT4 buffer：1ul ---------------------------------------------- 10ul 16度8-10h或过夜 上面公式中载体：片段的摩尔比为1:5，如果载体、片段的浓度太小而需要大量加的时候，你按相同的比例缩减所加的量。但载体的量为30-50ng是至少的。 |
4楼2014-07-18 15:02:42