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ninglihua

新虫 (初入文坛)

应助: 0 (幼儿园)
金币: 15
红花: 1
帖子: 7
在线: 2.5小时
虫号: 1620357
注册: 2012-02-16
性别: MM
专业: 药剂学

[求助] 目的片段载体片段连接不长菌已有5人参与

求助：
目前在做连接反应，目的片段3.7kb，载体片段5.5kb，均为双酶切后胶回收获得，将目的片段和载体片段进行连接，连接体系25ul(目的片段10ul，载体6ul，10*T4ligase buffer 2.5ul ,T4 ligase1ul)用的TAKALA家的T4连接酶试剂盒，16度连接过夜，化学转化，图板，均不长菌。做了阳性对照证明感受态和平板都是没有问题的，但为什么连接不长菌的，一个都不长，求各位大侠相助！帮帮忙吧

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1楼2014-07-18 10:05:44

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可帅儿

银虫 (正式写手)

应助: 14 (小学生)
金币: 652.1
散金: 39
红花: 4
帖子: 375
在线: 94.2小时
虫号: 1639660
注册: 2012-02-24
性别: MM
专业: 生物大分子结构与功能

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-07-27 21:12:43

对呀，回收下来的产物浓度怎样，应该要有20-30ng/ul最好。要保证回收下来有东西
我以前做连接的时候用的15ul体系：载体3ul，片段7ul，T4 buf 1.5ul，T4酶1ul
连接温度22摄氏度差不多1小时就够了
像你的片段这么大就要考虑在体系里多加些了，尽量加到8-8.5ul。体系里多一点没有太大问题的
仅供参考

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追随自己的心！不要做让自己后悔的事！

13楼2014-07-22 16:56:27

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