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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 目的片段与表达载体怎么都连接不上
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张冰宝

新虫 (小有名气)

[求助] 目的片段与表达载体怎么都连接不上 已有3人参与

最近一直在做原核表达，回收后的目的片段与表达载体pet-32a怎么都连接不上，已经试过十多次了，转化阳性质粒确定感受态和板子都没有问题。pet-32a没有问题（因为别的同门就连接上了），目的基因已经经过测序没有问题，就是胶回收后条带偏高一些。我重新回收了好几次结果都偏高。但是我同门回收的也偏高就连上了。。操作应该没有问题，连了半个多月了就是连不上，恳请知道的大侠们能指点一二，看看我这到底是哪出问题了，谢谢大家了
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1楼 2014-07-20 17:38:55
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张冰宝

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by gyesang at 2014-07-20 21:20:56
你是如何判断没有连上的？
板子上没有长出克隆还是长出了克隆经过鉴定都是假阳性，要说出你的现象，否则简单的连不上可能原因太多了。

有两次板子长了两三个克隆，我做的菌液pcr证实是假阳性。其他的就都是空板子了
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3楼2014-07-21 08:26:21
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-07-21 08:25:46
你是如何判断没有连上的？
板子上没有长出克隆还是长出了克隆经过鉴定都是假阳性，要说出你的现象，否则简单的连不上可能原因太多了。
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
2楼2014-07-20 21:20:56
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主
引用回帖:
3楼: Originally posted by 张冰宝 at 2014-07-21 08:26:21
有两次板子长了两三个克隆，我做的菌液pcr证实是假阳性。其他的就都是空板子了...

再说说你的连接体系和连接条件吧
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
4楼2014-07-27 20:48:02
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不爱做实验

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
张冰宝(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-07-28 11:12:02
方法一：交给你同门，让他做
方法二：参考同门的体系
方法三：重新再做一次，保证每一步没问题
总结：我最近也连不上，每一步又没什么问题，有的时候可能多少和运气有关吧。
另外，尝试将回收的片段用量提高，连接时间再延长，可以尝试连接一天一夜。
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5楼2014-07-28 10:21:20
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