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生化与分子

新虫 (初入文坛)

[求助] 目的基因片段胶回收后酶切,然后再跑胶后发现条带很弱,怎么改进(求助)

我要做目的基因的超表达,构建载体的第一步就遇到了困难,我在克隆了目的基因跑胶后做双酶切,然后再跑胶,发现目的条带很弱,根本没有回收的必要了,怎么改进才能得到较亮的酶切条带?请各位帮忙提点儿建议,不胜感激!
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zd0017

铁虫 (小有名气)


myprayer: 金币+1, 屏蔽内容, 应楼主要求,屏蔽咯 2013-05-12 15:55:45
本帖内容被屏蔽

6楼2013-05-12 10:12:31
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查看全部 9 个回答

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

你酶切回收后不是该做连接了吗,为什么还要再回收呢?做连接不用很多DNA呀。如果想得到更多的回收产物,加大初始反应体系和DNA的量。
2楼2012-10-31 07:37:21
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huangguoqing

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-10-31 15:18:04
个人建议,仅供参考!
1.扩增之后直接进行酶切,然后再对酶切产物进行胶回收;
2.胶回收效率本来就很低,无论是国产还是进口的试剂盒,反复胶回收肯定量很少;
3.我之前用过Omega的试剂盒,感觉不错;
4.胶回收最后的一步可以更换为ddH2O,更有益于克隆。
3楼2012-10-31 10:34:16
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考研生涯

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-10-31 15:18:15
PCR之后如果没有出现非特异性条带,直接做个PCR纯化就行了,要是非特异性条带比较多的话,建议胶回收,酶切之后验证一下就直接连接,不需要在胶回收了。PCR体系可以大点,比如2或者3*50ul。
4楼2012-10-31 11:06:14
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