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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 目的基因片段胶回收后酶切，然后再跑胶后发现条带很弱，怎么改进（求助）
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生化与分子

新虫 (初入文坛)

[求助] 目的基因片段胶回收后酶切，然后再跑胶后发现条带很弱，怎么改进（求助）

我要做目的基因的超表达，构建载体的第一步就遇到了困难，我在克隆了目的基因跑胶后做双酶切，然后再跑胶，发现目的条带很弱，根本没有回收的必要了，怎么改进才能得到较亮的酶切条带？请各位帮忙提点儿建议，不胜感激！
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1楼 2012-10-30 21:31:53
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考研生涯

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-10-31 15:18:15
PCR之后如果没有出现非特异性条带，直接做个PCR纯化就行了，要是非特异性条带比较多的话，建议胶回收，酶切之后验证一下就直接连接，不需要在胶回收了。PCR体系可以大点，比如2或者3*50ul。
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4楼2012-10-31 11:06:14
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
你酶切回收后不是该做连接了吗，为什么还要再回收呢？做连接不用很多DNA呀。如果想得到更多的回收产物，加大初始反应体系和DNA的量。
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2楼2012-10-31 07:37:21
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huangguoqing

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-10-31 15:18:04
个人建议，仅供参考！
1.扩增之后直接进行酶切，然后再对酶切产物进行胶回收；
2.胶回收效率本来就很低，无论是国产还是进口的试剂盒，反复胶回收肯定量很少；
3.我之前用过Omega的试剂盒，感觉不错；
4.胶回收最后的一步可以更换为ddH2O，更有益于克隆。
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3楼2012-10-31 10:34:16
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david0308

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-10-31 15:18:42
两种解决方案：1.一般来说如果PCR产物是单一条带的话，可以直接PCR产物回收，然后做双酶切，这样又简单产率也很高而且可以避免更多的突变产生。如果你的目的基因是在文库中拉的话那么其实第二步也可以直接产物回收的。2.如果担心纯度问题的话，最好还是割胶回收，但是呢，要加大PCR的量，而且在胶回收的过程中可以适当的改进，比如说胶回收在过柱子的过程中可以反复过滤3遍，提高产率，DDH2O少加一点，也可以的。
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哈哈
5楼2012-10-31 13:19:25
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