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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » T4酶切连接求助！
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melisax

新虫 (初入文坛)

[求助] T4酶切连接求助！

最近在做酶切连接，我用的载体上的多克隆位点，SALI和HIND3酶切切开之后与目的片段连接，目的片段也是用同样的酶从T载上切下来的，载体和片段都做了胶回收也跑过胶看过亮度了，浓度还可以的，然后按1比10体系加，T4连接过夜。我做了好久了平板上一点也不长。确认酶什么的都是没有问题的别人做都很正常，感受态我也换过几次也不长，用商业化的感受态也不长，平板抗生素也都是没有问题的。现在抓狂了，到底问题出在哪里都不知道，求大神解答！谢谢！！！

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1楼 2013-06-19 23:48:32
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melisax

新虫 (初入文坛)
一开始我怀疑载体自连或者酶切不干净，可是这样也起码会长假阳性吧，可是我的平板就是空的什么都没有。我的片段测过序了，酶切位点没有问题。

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2楼2013-06-19 23:50:35
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
melisax(myprayer代发): 金币+1, Gifts of roses, hand there are lingering fragrance. Look forward to your wonderful and more detailed answer. 2013-06-20 09:06:26
转化时要多做点对照便于分析。关于T4连接酶的对照，一般有载体双酶切自连、单酶切自连的对照。感受态的对照最好也做一下，就是转个同样抗性的质粒，确定转化步骤和操作没有问题。
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3楼2013-06-20 00:47:38
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Fleaves

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
是呀！做不出来最好做一下对照！
试试超感吧

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4楼2013-06-20 06:05:29
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bleach060452

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
melisax(gyesang代发): 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-06-26 12:28:02
既然这样，建议你尝试一下：
1. 分别以片段：载体的不同比例做2-3个体系同时连接；
2. 不知道你是多少度连接的？可以16度过夜转一次，剩下的继续放4度一段时间后再转
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岂能尽如人意，但求无愧我心
5楼2013-06-20 09:56:42
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dcb005

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-06-26 12:28:14
我的感觉是T4可能出问题了，去其他实验室借1ul，试验一下就是了
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★穷则独善其身,达则兼济天下★
6楼2013-06-20 11:04:27
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melisax

新虫 (初入文坛)
楼上说的对照啊酶啊这些问题都排除了。。。。。

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7楼2013-06-21 23:24:06
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melisax

新虫 (初入文坛)
可能是体系问题，我再试下吧。。。

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8楼2013-06-21 23:24:54
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xiaozhou0904

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
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kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-06-22 08:28:31
胶回收后要测dna回收到的浓度，然后做到绝对定量！链接的温度控制在16℃，过夜链接！
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9楼2013-06-22 00:11:00
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xiaozhou0904

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

胶回收后要测dna回收到的浓度，然后做到绝对定量！链接的温度控制在16℃，过夜链接！
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10楼2013-06-22 00:11:20
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