| 查看: 4412 | 回复: 15 | ||||
fayzhao金虫 (小有名气)
|
[求助]
双酶切后目的条带很淡，回收不到
|
|||
|
目前在做双酶切，目的是从T载体上把目的片段切下来，目的片段513bp。 用的是fermentas的常规内切酶，由于不能同时切，我选择的是连续酶切，以下是具体酶切体系。 第一种方案，具体如下，标记为1： 20ul体系：dd水 12ul 10xTango 2ul 质粒 5ul（约1ug） KpnI 1ul 37℃，5小时， 然后直接在管中再加入以下： 10xTango 2.5ul BglII 1ul 37℃，5小时 另一方案是从网上学的，具体如下，标记为2： 20ul体系：dd水 12ul 10xbuffer KpnI 2ul 质粒 5ul（约1ug） KpnI 1ul 37℃，5小时， 然后直接在管中再加入以下： dd水 25ul 10xbuffer 0 6ul BglII 1ul 37℃，5小时 但是双酶切之后，目的条带很淡，由于第一天时间不足，因此将酶切产物放在4℃，第二天切胶回收时没有回收到……请大家帮帮忙！O(∩_∩)O谢谢！ 图片如下：  顺序：质粒，双酶切1，双酶切2，2000marker.jpg |
回复此楼» 猜你喜欢
留学--博士招生
已经有16人回复
-
化学工程，本211，求调剂，ab区不限
已经有4人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有114人回复
-
湖北师范大学招调剂啦
已经有8人回复
-
邵阳学院食品与化学工程学院硕士调剂
已经有0人回复
-
天津商业大学 生物与医药课题组招生
已经有0人回复
-
生物化工学硕招收调剂
已经有0人回复
-
广东石油化工学院2026年硕士研究生需要多名生物，制药工程，食品专业的调剂生
已经有0人回复
-
317分 一志愿江南大学 化学工程学硕 求调剂
已经有6人回复
-
化工申博
已经有3人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 目的基因片段胶回收后酶切，然后再跑胶后发现条带很弱，怎么改进（求助）
已经有8人回复
- 双酶切没有切开，怎么回事啊
已经有6人回复
- 双酶切后目的片段变大
已经有11人回复
- 做双酶切 跑胶后什么都没有 是怎么回事？
已经有19人回复
- 双酶切后目的条带的疑问？
已经有8人回复
- 双酶切后载体片段变小
已经有8人回复
- 求助关于双酶切空载跑胶没有条带！
已经有15人回复
- PET-32a双酶切无法回收
已经有8人回复
- 双酶切，切不下来
已经有19人回复
- 质粒PCR大小正确，可是双酶切切不开
已经有8人回复
- 双酶切看不到小片段，为什么？
已经有19人回复
- 十万火急，重组质粒酶切只有一条带，测序有结果，但反复说我质粒浓度很低
已经有16人回复
- 双酶切的片段不见了？
已经有6人回复
- 双酶切切出了5条条带
已经有9人回复
- 【问题反馈】质粒双酶切切下120bp每次都看不到？
已经有21人回复
- 双酶切后目的条带下出现多个条带的原因
已经有9人回复
- 【求助/交流】双酶切质粒后，目的条带浅且前方有模糊亮带
已经有12人回复
酶切专家
金虫 (小有名气)
- MolEPI: 2
- 应助: 96 (初中生)
- 金币: 1610.8
- 红花: 4
- 帖子: 149
- 在线: 41.3小时
- 虫号: 1648414
- 注册: 2012-02-27
- 性别: GG
- 专业: 生物大分子结构与功能
【答案】应助回帖
★ ★
感谢参与，应助指数 +1
fayzhao: 金币+2, ★★★很有帮助, 非常感谢！ 2012-12-08 09:14:41
amisking: 回帖置顶 2012-12-08 18:55:14
感谢参与，应助指数 +1
fayzhao: 金币+2, ★★★很有帮助, 非常感谢！ 2012-12-08 09:14:41
amisking: 回帖置顶 2012-12-08 18:55:14
| 首先，你需要明确你需要回收到多少小片段。如果只是一个简单的亚克隆，那么你只要回收到200-300ng就足够了（因为一般回收时洗脱体积为20ul，洗脱后回收片段浓度为10-15ng/ul），考虑到回收效率为50%，因而理论上酶切后你的小片段量应该至少600ng，再结合你的原始质粒的大小，以及你的目的片段在原始载体中的比例，就可以计算出酶切时你需要的质粒DNA量。考虑到一般T载体的大小在3000bp左右，而你的目的片度为500bp，因而你至少需要酶切4ug左右的质粒，才能回收到合适浓度的目的基因片段，你的酶切实验只用了1ug质粒，你很难回收到足够量的目的基因片段。关于双酶切的具体设计，我建议你利用一个专门进行双酶切设计的软件（double digestion designer）进行设计，该软件不仅能够精确计算酶切时需要的酶量，而且可以自动推荐合适的buffer.该软件现在可以免费试用，你可以试试。该软件的链接在小木虫上可以搜到。 |
4楼2012-12-07 23:05:21
fayzhao
金虫 (小有名气)
- 应助: 5 (幼儿园)
- 金币: 809.6
- 帖子: 97
- 在线: 106.4小时
- 虫号: 1573744
- 注册: 2012-01-11
- 性别: MM
- 专业: 生物大分子结构与功能
7楼2012-12-10 16:03:35
fayzhao
金虫 (小有名气)
- 应助: 5 (幼儿园)
- 金币: 809.6
- 帖子: 97
- 在线: 106.4小时
- 虫号: 1573744
- 注册: 2012-01-11
- 性别: MM
- 专业: 生物大分子结构与功能
2楼2012-12-07 20:32:12
gyesang
荣誉版主 (著名写手)
-
专家经验: +24 - MolEPI: 31
- 应助: 599 (博士)
- 贵宾: 2.689
- 金币: 24334.9
- 散金: 1088
- 红花: 88
- 沙发: 2
- 帖子: 2327
- 在线: 623.1小时
- 虫号: 849017
- 注册: 2009-09-16
- 性别: GG
- 专业: 细胞信号转导
- 管辖: 分子生物
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
fayzhao: 金币+2, ★★★很有帮助, 非常感谢！ 2012-12-08 09:11:44
amisking: 金币+3, 鼓励发帖交流问题。 2012-12-08 18:55:09
感谢参与，应助指数 +1
fayzhao: 金币+2, ★★★很有帮助, 非常感谢！ 2012-12-08 09:11:44
amisking: 金币+3, 鼓励发帖交流问题。 2012-12-08 18:55:09
|
我查了一下楼主用的两个酶的buffer情况，的确他们不能共用buffer，且KpnI只能用KpnI buffer，楼主以上的两种切法都是可以的，看那个胶第二泳道其实可以回收了，也足够用于后续连接目标载体了，如果实在切不开的话。 这种情况，我把我的做法跟楼主分享下，我们实验室有四个公司的内切酶，分别有fermentas，takara，toyobo，NEB。我一般这是个公司的酶混用，但专一与NEB的buffer，长期实践经验表明，混用酶在NEB buffer里不影响酶切效果，所以楼主要是用NEB buffer的话，还是可以找到双酶切buffer的，可以在2+ BSA切 NEB双酶切buffer这里找： http://www.neb.com/nebecomm/DoubleDigestCalculator.asp |
3楼2012-12-07 23:03:08
fayzhao
金虫 (小有名气)
- 应助: 5 (幼儿园)
- 金币: 809.6
- 帖子: 97
- 在线: 106.4小时
- 虫号: 1573744
- 注册: 2012-01-11
- 性别: MM
- 专业: 生物大分子结构与功能
5楼2012-12-08 09:13:28
fayzhao
金虫 (小有名气)
- 应助: 5 (幼儿园)
- 金币: 809.6
- 帖子: 97
- 在线: 106.4小时
- 虫号: 1573744
- 注册: 2012-01-11
- 性别: MM
- 专业: 生物大分子结构与功能
6楼2012-12-08 09:15:49
platanus
木虫 (著名写手)
- 应助: 36 (小学生)
- 金币: 4570.3
- 散金: 113
- 红花: 2
- 帖子: 1261
- 在线: 152小时
- 虫号: 439482
- 注册: 2007-10-13
- 性别: GG
- 专业: 观赏园艺学
8楼2012-12-10 17:21:39
fayzhao
金虫 (小有名气)
- 应助: 5 (幼儿园)
- 金币: 809.6
- 帖子: 97
- 在线: 106.4小时
- 虫号: 1573744
- 注册: 2012-01-11
- 性别: MM
- 专业: 生物大分子结构与功能
9楼2012-12-10 18:06:59
lillian菲
银虫 (小有名气)
- 应助: 22 (小学生)
- 金币: 1474.2
- 红花: 3
- 帖子: 74
- 在线: 29.3小时
- 虫号: 1642017
- 注册: 2012-02-25
- 性别: MM
- 专业: 生物化学
10楼2012-12-10 18:16:05
