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fayzhao金虫 (小有名气)
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双酶切后目的条带很淡，回收不到
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目前在做双酶切，目的是从T载体上把目的片段切下来，目的片段513bp。 用的是fermentas的常规内切酶，由于不能同时切，我选择的是连续酶切，以下是具体酶切体系。 第一种方案，具体如下，标记为1： 20ul体系：dd水 12ul 10xTango 2ul 质粒 5ul（约1ug） KpnI 1ul 37℃，5小时， 然后直接在管中再加入以下： 10xTango 2.5ul BglII 1ul 37℃，5小时 另一方案是从网上学的，具体如下，标记为2： 20ul体系：dd水 12ul 10xbuffer KpnI 2ul 质粒 5ul（约1ug） KpnI 1ul 37℃，5小时， 然后直接在管中再加入以下： dd水 25ul 10xbuffer 0 6ul BglII 1ul 37℃，5小时 但是双酶切之后，目的条带很淡，由于第一天时间不足，因此将酶切产物放在4℃，第二天切胶回收时没有回收到……请大家帮帮忙！O(∩_∩)O谢谢！ 图片如下：  顺序：质粒，双酶切1，双酶切2，2000marker.jpg |
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| 首先，你需要明确你需要回收到多少小片段。如果只是一个简单的亚克隆，那么你只要回收到200-300ng就足够了（因为一般回收时洗脱体积为20ul，洗脱后回收片段浓度为10-15ng/ul），考虑到回收效率为50%，因而理论上酶切后你的小片段量应该至少600ng，再结合你的原始质粒的大小，以及你的目的片段在原始载体中的比例，就可以计算出酶切时你需要的质粒DNA量。考虑到一般T载体的大小在3000bp左右，而你的目的片度为500bp，因而你至少需要酶切4ug左右的质粒，才能回收到合适浓度的目的基因片段，你的酶切实验只用了1ug质粒，你很难回收到足够量的目的基因片段。关于双酶切的具体设计，我建议你利用一个专门进行双酶切设计的软件（double digestion designer）进行设计，该软件不仅能够精确计算酶切时需要的酶量，而且可以自动推荐合适的buffer.该软件现在可以免费试用，你可以试试。该软件的链接在小木虫上可以搜到。 |
4楼2012-12-07 23:05:21
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我查了一下楼主用的两个酶的buffer情况，的确他们不能共用buffer，且KpnI只能用KpnI buffer，楼主以上的两种切法都是可以的，看那个胶第二泳道其实可以回收了，也足够用于后续连接目标载体了，如果实在切不开的话。 这种情况，我把我的做法跟楼主分享下，我们实验室有四个公司的内切酶，分别有fermentas，takara，toyobo，NEB。我一般这是个公司的酶混用，但专一与NEB的buffer，长期实践经验表明，混用酶在NEB buffer里不影响酶切效果，所以楼主要是用NEB buffer的话，还是可以找到双酶切buffer的，可以在2+ BSA切 NEB双酶切buffer这里找： http://www.neb.com/nebecomm/DoubleDigestCalculator.asp |
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