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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 双酶切后目的条带很淡，回收不到
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fayzhao

金虫 (小有名气)

[求助] 双酶切后目的条带很淡，回收不到

目前在做双酶切，目的是从T载体上把目的片段切下来，目的片段513bp。
用的是fermentas的常规内切酶，由于不能同时切，我选择的是连续酶切，以下是具体酶切体系。
第一种方案，具体如下，标记为1：
20ul体系：dd水 12ul              
                 10xTango  2ul
                 质粒 5ul（约1ug）
         KpnI   1ul
       37℃，5小时，
然后直接在管中再加入以下：
          10xTango  2.5ul
                 BglII     1ul
        37℃，5小时

另一方案是从网上学的，具体如下，标记为2：
20ul体系：dd水 12ul              
                 10xbuffer KpnI 2ul
                 质粒 5ul（约1ug）
         KpnI   1ul
       37℃，5小时，
然后直接在管中再加入以下：
          dd水 25ul              
          10xbuffer 0  6ul
                 BglII     1ul
        37℃，5小时
但是双酶切之后，目的条带很淡，由于第一天时间不足，因此将酶切产物放在4℃，第二天切胶回收时没有回收到……请大家帮帮忙！O(∩_∩)O谢谢！
图片如下：

顺序：质粒，双酶切1，双酶切2，2000marker.jpg
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1楼2012-12-07 20:24:49
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回帖置顶 ( 共有2个 )

酶切专家

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
fayzhao: 金币+2, ★★★很有帮助, 非常感谢！ 2012-12-08 09:14:41
amisking: 回帖置顶 2012-12-08 18:55:14
首先，你需要明确你需要回收到多少小片段。如果只是一个简单的亚克隆，那么你只要回收到200-300ng就足够了（因为一般回收时洗脱体积为20ul，洗脱后回收片段浓度为10-15ng/ul），考虑到回收效率为50%，因而理论上酶切后你的小片段量应该至少600ng，再结合你的原始质粒的大小，以及你的目的片段在原始载体中的比例，就可以计算出酶切时你需要的质粒DNA量。考虑到一般T载体的大小在3000bp左右，而你的目的片度为500bp，因而你至少需要酶切4ug左右的质粒，才能回收到合适浓度的目的基因片段，你的酶切实验只用了1ug质粒，你很难回收到足够量的目的基因片段。关于双酶切的具体设计，我建议你利用一个专门进行双酶切设计的软件（double digestion designer）进行设计，该软件不仅能够精确计算酶切时需要的酶量，而且可以自动推荐合适的buffer.该软件现在可以免费试用，你可以试试。该软件的链接在小木虫上可以搜到。
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4楼2012-12-07 23:05:21
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fayzhao

金虫 (小有名气)
fayzhao: 回帖置顶 2012-12-10 16:03:43
我双酶切之后切胶回收的，今天测得浓度好低，并且纯度也不好，不知道怎么回事啊，请大家帮帮我，O(∩_∩)O谢谢啦
今天测得浓度，一个4.2ng/ul,一个6.9ng/ul.但是我回收之后跑电泳能看到条带的呀，并且和marker亮度差不多的，好奇怪呀
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7楼2012-12-10 16:03:35
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普通回帖

fayzhao

金虫 (小有名气)
补充：质粒是用试剂盒提的，浓度220ng/ul，A260/A280=1.88
         酶是刚买的，应该没有问题
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2楼2012-12-07 20:32:12
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
fayzhao: 金币+2, ★★★很有帮助, 非常感谢！ 2012-12-08 09:11:44
amisking: 金币+3, 鼓励发帖交流问题。 2012-12-08 18:55:09
我查了一下楼主用的两个酶的buffer情况，的确他们不能共用buffer，且KpnI只能用KpnI buffer，楼主以上的两种切法都是可以的，看那个胶第二泳道其实可以回收了，也足够用于后续连接目标载体了，如果实在切不开的话。

这种情况，我把我的做法跟楼主分享下，我们实验室有四个公司的内切酶，分别有fermentas，takara，toyobo，NEB。我一般这是个公司的酶混用，但专一与NEB的buffer，长期实践经验表明，混用酶在NEB buffer里不影响酶切效果，所以楼主要是用NEB buffer的话，还是可以找到双酶切buffer的，可以在2+ BSA切
NEB双酶切buffer这里找：
http://www.neb.com/nebecomm/DoubleDigestCalculator.asp
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
3楼2012-12-07 23:03:08
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fayzhao

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by gyesang at 2012-12-07 23:03:08
我查了一下楼主用的两个酶的buffer情况，的确他们不能共用buffer，且KpnI只能用KpnI buffer，楼主以上的两种切法都是可以的，看那个胶第二泳道其实可以回收了，也足够用于后续连接目标载体了，如果实在切不开的话。 ...

酶切产物放在4℃一晚上，我第二天切胶回收的，结果条带更淡了，回收之后电泳检测不到目的条带。
我今天加大量再试一次，看看能不能回收到吧
O(∩_∩)O谢谢你啦！
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5楼2012-12-08 09:13:28
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fayzhao

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 酶切专家 at 2012-12-07 23:05:21
首先，你需要明确你需要回收到多少小片段。如果只是一个简单的亚克隆，那么你只要回收到200-300ng就足够了（因为一般回收时洗脱体积为20ul，洗脱后回收片段浓度为10-15ng/ul），考虑到回收效率为50%，因而理论上酶切 ...

酶切4ug质粒的话，需要用80ul体系吗？还是只用少加一些水多加一些其他成分呢？
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6楼2012-12-08 09:15:49
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platanus

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
fayzhao: 金币+2, ★★★很有帮助 2012-12-10 18:03:58
我以前做这种实验的时候就是第一次酶切多切几管，每管50的体系，然后合并回收，再第二次酶切就可以回收到浓度比较高的目的产物了，方法比较笨啊。
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8楼2012-12-10 17:21:39
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fayzhao

金虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by platanus at 2012-12-10 17:21:39
我以前做这种实验的时候就是第一次酶切多切几管，每管50的体系，然后合并回收，再第二次酶切就可以回收到浓度比较高的目的产物了，方法比较笨啊。

你说的这种是分别单酶切的吗？
我现在找到一种可以同步双酶切的方法了，如果同步双酶切的话，怎么做呢？谢谢
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9楼2012-12-10 18:06:59
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lillian菲

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
fayzhao: 金币+2, ★有帮助, O(∩_∩)O谢谢 2012-12-10 20:16:18
你好，我以前都做双酶切，产物量太少，进行下面实验太不方便，后来就用两次单酶切，每次酶切时体系用的多一点，纯化或回收的时候就不会有量太少的问题了
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10楼2012-12-10 18:16:05
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