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865310007

木虫 (小有名气)

[交流] 内切酶和连接酶buffer的选择

体系中需要加入连接酶和内切酶，那buffer怎么办呢？两个buffer成分差不多，如果10微升体系，那buffer是各加1微升10*的，还是加一个就可以了呢？更或者说，每个都加0.5微升？？？
如果两个buffer都加的话，那溶液中盐离子浓度会不会太高了呢？会不会影响酶的活性？
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1楼 2012-03-11 21:59:31
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j2

木虫 (正式写手)
★
865310007(金币+1): 谢谢参与
又连接又切？？？孤陋寡闻了，这是什么情况？
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2楼2012-03-12 10:21:11
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dorecnu

木虫 (正式写手)
★
865310007(金币+1): 谢谢参与
请楼主先解释一下，您的实验目的是什么？为什么不酶切后回收片段，然后再连接。在避免了buffer不同的同时每一步都可以检测，便于后面设置连接反应。
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5楼2012-03-12 12:01:10
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张晓梅ZXM

金虫 (正式写手)
★
865310007(金币+1): 谢谢参与
好想见识见识酶切和连接一起的
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6楼2012-03-12 13:27:23
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jting0912

新虫 (初入文坛)
★
865310007(金币+1): 谢谢参与
应该先各自进行酶切，验证酶切成功后再连接吧~~~~~~~~~~~~~
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3楼2012-03-12 11:08:47
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susizheng

木虫 (著名写手)
★
865310007(金币+1): 谢谢参与
内切酶切完后，体系灭活，再用加连接酶连接吧，buffer可以共用，但是加连接酶时要额外加ATP提供能量。
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4楼2012-03-12 11:17:55
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holygoof

新虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5): 给个红包，谢谢回帖
如果有任何疑问或建议，请google
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7楼2012-03-12 15:38:42
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865310007

木虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by susizheng at 2012-03-12 11:17:55:
内切酶切完后，体系灭活，再用加连接酶连接吧，buffer可以共用，但是加连接酶时要额外加ATP提供能量。

buffer可以共用吗？我看文献里面两个酶是同时加的，而且只加了连接酶的buffer，没有加内切酶的buffer，但是我就做不出来，现在考虑buffer的问题，两个buffer共用不会使溶液中盐离子浓度升高吗？不会影响酶的活性吗?
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8楼2012-03-12 21:29:04
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susizheng

木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5): 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
8楼: Originally posted by 865310007 at 2012-03-12 21:29:04:
buffer可以共用吗？我看文献里面两个酶是同时加的，而且只加了连接酶的buffer，没有加内切酶的buffer，但是我就做不出来，现在考虑buffer的问题，两个buffer共用不会使溶液中盐离子浓度升高吗？不会影响酶的活性吗?

我们做连接的时候，载体酶切一般都不回收，直接将载体酶切体系加酶切回收片段连接，加连接酶加ATP，不再加连接酶的buffer，因为离子浓度太高对酶活影响较大。
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9楼2012-03-12 21:41:58
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865310007

木虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by susizheng at 2012-03-12 21:41:58:
我们做连接的时候，载体酶切一般都不回收，直接将载体酶切体系加酶切回收片段连接，加连接酶加ATP，不再加连接酶的buffer，因为离子浓度太高对酶活影响较大。

我的体系是先链接，然后酶切。
我加的1倍的连接酶buffer，内切酶的buffer就不知道该怎么加了，试过不加内切酶buffer、0.5倍内切酶buffer和1倍内切酶buffer，感觉现象很乱，应该是内切酶没起作用，不知道是不是buffer的原因，感觉总这么试buffer的量也挺浪费时间的
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10楼2012-03-13 11:28:49
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wshi85

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我也想做这个方面的实验，请问你做成了没？还有你看的是哪篇文献，能否告知，谢谢！
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11楼2014-04-22 23:38:57
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