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865310007

木虫 (小有名气)


[交流] 内切酶和连接酶buffer的选择

体系中需要加入连接酶和内切酶,那buffer怎么办呢?两个buffer成分差不多,如果10微升体系,那buffer是各加1微升10*的,还是加一个就可以了呢?更或者说,每个都加0.5微升???
如果两个buffer都加的话,那溶液中盐离子浓度会不会太高了呢?会不会影响酶的活性?
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小木虫(金币+0.5): 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
8楼: Originally posted by 865310007 at 2012-03-12 21:29:04:
buffer可以共用吗?我看文献里面两个酶是同时加的,而且只加了连接酶的buffer,没有加内切酶的buffer,但是我就做不出来,现在考虑buffer的问题,两个buffer共用不会使溶液中盐离子浓度升高吗?不会影响酶的活性吗?

我们做连接的时候,载体酶切一般都不回收,直接将载体酶切体系加酶切回收片段连接,加连接酶加ATP,不再加连接酶的buffer,因为离子浓度太高对酶活影响较大。
9楼2012-03-12 21:41:58
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j2

木虫 (正式写手)



865310007(金币+1): 谢谢参与
又连接又切???孤陋寡闻了,这是什么情况?
2楼2012-03-12 10:21:11
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jting0912

新虫 (初入文坛)



865310007(金币+1): 谢谢参与
应该先各自进行酶切,验证酶切成功后再连接吧~~~~~~~~~~~~~
3楼2012-03-12 11:08:47
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865310007(金币+1): 谢谢参与
内切酶切完后,体系灭活,再用加连接酶连接吧,buffer可以共用,但是加连接酶时要额外加ATP提供能量。
4楼2012-03-12 11:17:55
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