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865310007

木虫 (小有名气)


[交流] 内切酶和连接酶buffer的选择

体系中需要加入连接酶和内切酶,那buffer怎么办呢?两个buffer成分差不多,如果10微升体系,那buffer是各加1微升10*的,还是加一个就可以了呢?更或者说,每个都加0.5微升???
如果两个buffer都加的话,那溶液中盐离子浓度会不会太高了呢?会不会影响酶的活性?
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j2

木虫 (正式写手)



865310007(金币+1): 谢谢参与
又连接又切???孤陋寡闻了,这是什么情况?
2楼2012-03-12 10:21:11
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dorecnu

木虫 (正式写手)



865310007(金币+1): 谢谢参与
请楼主先解释一下,您的实验目的是什么?为什么不酶切后回收片段,然后再连接。在避免了buffer不同的同时每一步都可以检测,便于后面设置连接反应。
5楼2012-03-12 12:01:10
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张晓梅ZXM

金虫 (正式写手)



865310007(金币+1): 谢谢参与
好想见识见识酶切和连接一起的
6楼2012-03-12 13:27:23
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普通回帖

jting0912

新虫 (初入文坛)



865310007(金币+1): 谢谢参与
应该先各自进行酶切,验证酶切成功后再连接吧~~~~~~~~~~~~~
3楼2012-03-12 11:08:47
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865310007(金币+1): 谢谢参与
内切酶切完后,体系灭活,再用加连接酶连接吧,buffer可以共用,但是加连接酶时要额外加ATP提供能量。
4楼2012-03-12 11:17:55
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holygoof

新虫 (小有名气)



小木虫(金币+0.5): 给个红包,谢谢回帖
如果有任何疑问或建议,请google
7楼2012-03-12 15:38:42
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865310007

木虫 (小有名气)


引用回帖:
: Originally posted by susizheng at 2012-03-12 11:17:55:
内切酶切完后,体系灭活,再用加连接酶连接吧,buffer可以共用,但是加连接酶时要额外加ATP提供能量。

buffer可以共用吗?我看文献里面两个酶是同时加的,而且只加了连接酶的buffer,没有加内切酶的buffer,但是我就做不出来,现在考虑buffer的问题,两个buffer共用不会使溶液中盐离子浓度升高吗?不会影响酶的活性吗?
8楼2012-03-12 21:29:04
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小木虫(金币+0.5): 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
8楼: Originally posted by 865310007 at 2012-03-12 21:29:04:
buffer可以共用吗?我看文献里面两个酶是同时加的,而且只加了连接酶的buffer,没有加内切酶的buffer,但是我就做不出来,现在考虑buffer的问题,两个buffer共用不会使溶液中盐离子浓度升高吗?不会影响酶的活性吗?

我们做连接的时候,载体酶切一般都不回收,直接将载体酶切体系加酶切回收片段连接,加连接酶加ATP,不再加连接酶的buffer,因为离子浓度太高对酶活影响较大。
9楼2012-03-12 21:41:58
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865310007

木虫 (小有名气)


引用回帖:
: Originally posted by susizheng at 2012-03-12 21:41:58:
我们做连接的时候,载体酶切一般都不回收,直接将载体酶切体系加酶切回收片段连接,加连接酶加ATP,不再加连接酶的buffer,因为离子浓度太高对酶活影响较大。

我的体系是先链接,然后酶切。
我加的1倍的连接酶buffer,内切酶的buffer就不知道该怎么加了,试过不加内切酶buffer、0.5倍内切酶buffer和1倍内切酶buffer,感觉现象很乱,应该是内切酶没起作用,不知道是不是buffer的原因,感觉总这么试buffer的量也挺浪费时间的
10楼2012-03-13 11:28:49
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wshi85

木虫 (正式写手)



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
我也想做这个方面的实验,请问你做成了没?还有你看的是哪篇文献,能否告知,谢谢!
11楼2014-04-22 23:38:57
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