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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 急求酶切，回收及连接详细操作步骤
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zuohuihui

木虫 (正式写手)

[求助] 急求酶切，回收及连接详细操作步骤已有1人参与

由于之前做酶切连接一直不成功，按照大家给我的建议我也试了一下，但转化时还是一个菌落都不长，我的详细操作步骤是：
首先PCR扩增目的片段，连T载体，双酶切看有无大小合适片段被切下来，切成功后送测序，确保目的片段正确。然后分别双酶切载体和T载体，我采用的30ul体系，载体加10ul，T载体加15ul，酶切两份T载体，跑胶，凝胶回收。我的载体和T载体都是取过夜摇的菌液3-4ml，12000rmp离心收菌，天根小提试剂盒提取质粒。回收也是按照天根试剂盒说明书进行，最后中体积40ul，但5ul酶切回收的载体及目的片段跑胶，载体几乎看不到条带，测了一下浓度，很低，目的片段浓度还可以，按照载体和目的片段浓度1:9，用takara的solutionI进行连接，原本30度连接半小时，没有成功，后来尝试16度过夜也没有菌落生成，而且我的感受态也是新做的，做此实验一个多月了一直没有成功，因为在生物知识方面经验很少，还请各位多多帮忙分析原因，或者麻烦你们把你们的详细操作告知一下，非常非常感谢
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1楼2013-07-08 11:45:38
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华农夏田

铁虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 鼓励发帖积极交流，分子生物期待你更多精彩 2013-07-08 17:06:49

dcb005

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zuohuihui: 金币+2, ★★★★★最佳答案 2013-07-08 13:46:31
myprayer: 金币+1, 回答很好，perfect 2013-07-08 17:06:37

zuohuihui

木虫 (正式写手)

zuohuihui

木虫 (正式写手)
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