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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 有谁试过双酶切的同时加碱性磷酸酶
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yicao917

木虫 (小有名气)

[求助] 有谁试过双酶切的同时加碱性磷酸酶

请问有没人将BamHI和XhoI在BamHI buffer中双酶切的同时加入碱性磷酸酶的啊，若有的话要如何处理才能使酶切产物用于后续连接？
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1楼 2011-10-03 22:11:27
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萝卜丝儿

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

只要和它连接的另一个片段 在酶切时不要加入碱性磷酸酶 就可以连接了 不用做别的处理
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好好学习，天天向上！
2楼2011-10-03 22:22:56
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yicao917

木虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 萝卜丝儿 at 2011-10-03 22:22:56:
只要和它连接的另一个片段 在酶切时不要加入碱性磷酸酶 就可以连接了 不用做别的处理

什么意思啊，双酶切时加入碱性磷酸酶，然后不用将碱性磷酸酶失活就可以直接取一部分用于连接是吗？
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3楼2011-10-03 22:44:23
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萝卜丝儿

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

yicao917(金币+10): 好的，谢谢啦，我知道你是怎么做的了，我是想知道跑胶回收这步能不能偷懒省掉，因为比较麻烦而且回收率比较低只有30% 2011-10-04 23:08:46
你酶切好后，不跑电泳切胶回收吗？那个过程碱性磷酸酶就被去除了呀。
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好好学习，天天向上！
4楼2011-10-04 00:50:22
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萝卜丝儿

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

就是连接的话，肯定是两个片段连接的咯，只要其中的一个片段用碱性磷酸酶处理后，就可以了，然后双酶切后，跑电泳切胶回收片段，再纯化，纯化的过程中碱性磷酸酶就已经被去除了。另一个片段双酶切的时候，不要用碱性磷酸酶处理就可以，然后直接电泳切胶回收纯化。然后用T4过夜连接即可。我是这么做的。希望能帮到你！
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5楼2011-10-04 01:10:58
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