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yicao917

木虫 (小有名气)

[求助] 有谁试过双酶切的同时加碱性磷酸酶

请问有没人将BamHI和XhoI在BamHI buffer中双酶切的同时加入碱性磷酸酶的啊,若有的话要如何处理才能使酶切产物用于后续连接?
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萝卜丝儿

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

就是连接的话,肯定是两个片段连接的咯,只要其中的一个片段用碱性磷酸酶处理后,就可以了,然后双酶切后,跑电泳切胶回收片段,再纯化,纯化的过程中碱性磷酸酶就已经被去除了。另一个片段双酶切的时候,不要用碱性磷酸酶处理就可以,然后直接电泳切胶回收纯化。然后用T4过夜连接即可。我是这么做的。希望能帮到你!
好好学习,天天向上!
5楼2011-10-04 01:10:58
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萝卜丝儿

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

只要和它连接的另一个片段 在酶切时不要加入碱性磷酸酶 就可以连接了 不用做别的处理
好好学习,天天向上!
2楼2011-10-03 22:22:56
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yicao917

木虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 萝卜丝儿 at 2011-10-03 22:22:56:
只要和它连接的另一个片段 在酶切时不要加入碱性磷酸酶 就可以连接了 不用做别的处理

什么意思啊,双酶切时加入碱性磷酸酶,然后不用将碱性磷酸酶失活就可以直接取一部分用于连接是吗?
3楼2011-10-03 22:44:23
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萝卜丝儿

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

yicao917(金币+10): 好的,谢谢啦,我知道你是怎么做的了,我是想知道跑胶回收这步能不能偷懒省掉,因为比较麻烦而且回收率比较低只有30% 2011-10-04 23:08:46
你酶切好后,不跑电泳切胶回收吗?那个过程碱性磷酸酶就被去除了呀。
好好学习,天天向上!
4楼2011-10-04 00:50:22
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