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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » T载连接后进行双酶切结果什么都没有了
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love犬夜叉

木虫 (小有名气)

[求助] T载连接后进行双酶切结果什么都没有了 已有2人参与

我是做定点突变，将突变的片段连到T载上，测序验证，用菌落PCR检验的时候都有目的条带，提的质粒也比19T的条带要大些，就是条带不止三条，差不多有五六条的样子，然后双酶切，做了几次了，都是一跑胶检测就是什么条带都看不到了，泳道也没有明显的亮带，的酶切体系是质粒7μl，BamH I 0.2,Hind III o.2,10X K Buffer 1,ddH2O 1.6,时间有过夜，也有4、5个小时的，以前构过T载，也做过双酶切， 但是都没有出现过这样的情况，求助啊！！！！！！实验进度拖得太久了~~~~(>_<~~~~
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justloveinuyasha
1楼 2014-06-27 16:57:09
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love犬夜叉

木虫 (小有名气)
对了，补充下，有拿菌液去测序但是没有信号，提的质粒做PCR，虽然有的没有P出来，但是还是有P出来的，可是酶切的时候都没有任何条带
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justloveinuyasha
2楼2014-06-27 17:00:08
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aayqaa

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖交流！ 2014-06-27 22:18:14
1，质粒能提出五六条带？建议还是用试剂盒提吧，用试剂盒一般都是一两条带，试剂盒也不贵。
2，PCR鉴定还是很不可靠的，你的引物是否特异性不是很好？
3，酶切体系太小了，鉴定时目的条带往往比较淡，很有可能看不到，建议2微升酶切体系跑胶时全部加到一个孔里
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3楼2014-06-27 20:00:13
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aayqaa

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by aayqaa at 2014-06-27 20:00:13
1，质粒能提出五六条带？建议还是用试剂盒提吧，用试剂盒一般都是一两条带，试剂盒也不贵。
2，PCR鉴定还是很不可靠的，你的引物是否特异性不是很好？
3，酶切体系太小了，鉴定时目的条带往往比较淡，很有可能看不 ...

20微升
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4楼2014-06-27 20:11:50
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eaeas12

禁虫 (初入文坛)
★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2014-07-15 20:54:21
本帖内容被屏蔽
5楼2014-06-29 23:11:40
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)
质粒7μl大约多少ug？   切下的片段多大？
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6楼2014-06-30 16:24:55
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love犬夜叉

木虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by aayqaa at 2014-06-27 20:00:13
1，质粒能提出五六条带？建议还是用试剂盒提吧，用试剂盒一般都是一两条带，试剂盒也不贵。
2，PCR鉴定还是很不可靠的，你的引物是否特异性不是很好？
3，酶切体系太小了，鉴定时目的条带往往比较淡，很有可能看不 ...

但是就是提出来很多条带啊，而且很亮，这次重新做了连接，重新踢了质粒。有两个是标准的三条带，而且很清晰，也比空载大一点，但是酶切之后还是什么都没有了！
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justloveinuyasha
7楼2014-07-29 16:28:43
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