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ljy241

新虫 (小有名气)

[求助] 双酶切后如何才能让载体自连？ 已有1人参与

我想对一个质粒进行改造，要把其中一段序列去掉，需要用SacII和PmlI这两个酶。胶回收后的载体如何才能再自己连起来？
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1楼 2014-02-26 12:19:09
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atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-03-31 01:35:37
...
    要削成平端吗，再自连比较合适？用有外切酶活性的聚合酶来消就似乎可以了
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Let God do with it as He wills
2楼2014-02-26 13:35:27
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小love肖

铜虫 (初入文坛)
你可以用Pfu酶把末端补齐，变成平末端后再连接转化；如果载体不大，可以用反向PCR去掉的不想要的序列，不过要用高保真酶
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3楼2014-02-27 11:38:03
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lin1987

新虫 (初入文坛)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-03-31 01:35:58
要是这段序列在基因上面，以上的两种方法都很有可能会使阅读框改变，不如合成一段序列同时不会改变阅读框，使他们两端带有这两个配对的没切位点，直接连接，就像构建sh质粒一样。
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4楼2014-02-28 12:03:14
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ljy241

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by atlanticwi at 2014-02-26 13:35:27
...
    要削成平端吗，再自连比较合适？用有外切酶活性的聚合酶来消就似乎可以了

你们一般用什么聚合酶，体系和条件是怎么样的？
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5楼2014-02-28 23:19:38
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atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气
引用回帖:
5楼: Originally posted by ljy241 at 2014-02-28 23:19:38
你们一般用什么聚合酶，体系和条件是怎么样的？...

是指削成平端，还是补成平端
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Let God do with it as He wills
6楼2014-03-01 19:42:03
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ljy241

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by atlanticwi at 2014-03-01 19:42:03
是指削成平端，还是补成平端...

削平还是补平都无所谓
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7楼2014-03-05 14:05:46
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