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love犬夜叉

木虫 (小有名气)

[求助] T载连接后进行双酶切结果什么都没有了 已有2人参与

我是做定点突变,将突变的片段连到T载上,测序验证,用菌落PCR检验的时候都有目的条带,提的质粒也比19T的条带要大些,就是条带不止三条,差不多有五六条的样子,然后双酶切,做了几次了,都是一跑胶检测就是什么条带都看不到了,泳道也没有明显的亮带,的酶切体系是质粒7μl,BamH I 0.2,Hind III o.2,10X K Buffer 1,ddH2O 1.6,时间有过夜,也有4、5个小时的,以前构过T载,也做过双酶切, 但是都没有出现过这样的情况,求助啊!!!!!!实验进度拖得太久了~~~~(>_<~~~~
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justloveinuyasha
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love犬夜叉

木虫 (小有名气)

对了,补充下,有拿菌液去测序但是没有信号,提的质粒做PCR,虽然有的没有P出来,但是还是有P出来的,可是酶切的时候都没有任何条带
justloveinuyasha
2楼2014-06-27 17:00:08
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aayqaa

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖交流! 2014-06-27 22:18:14
1,质粒能提出五六条带?建议还是用试剂盒提吧,用试剂盒一般都是一两条带,试剂盒也不贵。
2,PCR鉴定还是很不可靠的,你的引物是否特异性不是很好?
3,酶切体系太小了,鉴定时目的条带往往比较淡,很有可能看不到,建议2微升酶切体系跑胶时全部加到一个孔里
3楼2014-06-27 20:00:13
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aayqaa

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by aayqaa at 2014-06-27 20:00:13
1,质粒能提出五六条带?建议还是用试剂盒提吧,用试剂盒一般都是一两条带,试剂盒也不贵。
2,PCR鉴定还是很不可靠的,你的引物是否特异性不是很好?
3,酶切体系太小了,鉴定时目的条带往往比较淡,很有可能看不 ...

20微升
4楼2014-06-27 20:11:50
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eaeas12

禁虫 (初入文坛)


感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流! 2014-07-15 20:54:21
本帖内容被屏蔽

5楼2014-06-29 23:11:40
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)

质粒7μl大约多少ug?   切下的片段多大?
6楼2014-06-30 16:24:55
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love犬夜叉

木虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by aayqaa at 2014-06-27 20:00:13
1,质粒能提出五六条带?建议还是用试剂盒提吧,用试剂盒一般都是一两条带,试剂盒也不贵。
2,PCR鉴定还是很不可靠的,你的引物是否特异性不是很好?
3,酶切体系太小了,鉴定时目的条带往往比较淡,很有可能看不 ...

但是就是提出来很多条带啊,而且很亮,这次重新做了连接,重新踢了质粒。有两个是标准的三条带,而且很清晰,也比空载大一点,但是酶切之后还是什么都没有了!
justloveinuyasha
7楼2014-07-29 16:28:43
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