应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

Znn3bq.jpeg
小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 酶切酶连转化后单克隆检测不对
91/1返回列表
查看: 1830  |  回复: 8
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

fxj1986

木虫 (正式写手)

[交流] 酶切酶连转化后单克隆检测不对

自己构建的载体，片段7K左右；片段（3k）通过PCR扩增；电泳后回收进行酶切，酶切条件37℃，3h；再电泳后回收，酶连时载体：片段=1:1.5左右，转化DH5α，16h（氯霉素抗性）平板上单克隆很多；挑取单克隆进行菌落PCR验证（引物为自己设计），电泳结果显示除了目的条带外还有其他条带；对单克隆培养重新提取质粒进行双酶切后，只检测出一条带（与质粒大小基本一致），没有片段的目的条带。几次转化都如此，求分析，求经验！
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:

» 抢金币啦！回帖就可以得到:

查看全部散金贴
1楼 2012-10-12 15:52:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

kk26

木虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
fxj1986: 金币+1, 谢谢，同勉 2012-10-12 22:34:40
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-10-13 16:30:16
做过以未连入片段的质粒为模板的阴性对照PCR吗？怀疑你没有连入片段，pcr筛菌出来的并非阳性克隆。

我目前也筛不到阳性克隆，同样郁闷，继续做做！
同祝好运！
赞一下 回复此楼
2楼2012-10-12 17:28:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

酶切专家

金虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
fxj1986: 金币+3, 谢谢 2012-10-12 22:35:36
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-10-13 16:30:30
应该是载体酶切不完全（没有完全进行双酶切）。不知道你用的是什么酶。不同酶的用量会差5-30倍。你可以用double digestion designer设计你的酶切实验，确保载体酶切完全，基本没有背景克隆。你可以在小木虫上搜到的。祝好运。
赞一下 回复此楼
3楼2012-10-12 20:32:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

faile18

金虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
fxj1986: 金币+1, 引物是一样的，正在改变酶切条件 2012-10-13 10:26:32
小丹木木: 金币+3, 光路交流 2012-10-13 16:30:40
小丹木木: 操作失误，不好意思 2012-10-13 16:31:02
有点疑问，也有点小建议：
1. 可以考虑蓝白斑筛选，初步滤掉空载体，白色克隆PCR检测，（这里有个疑问，你PCR验证时说引物自己设计，不知道你这对引物与你之前PCR扩增3K片段时是否一样，如果不一样可以考虑用那对引物扩增来检测一下）。
2. 确定下质粒双酶切体系是否兼容，比如buffer，酶用量等都会有影响。
3. 你的载体自身是否work？
祝好运。
赞一下 回复此楼
4楼2012-10-13 04:15:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
fxj1986: 金币+1 2012-10-13 10:26:43
首先确保用的两个酶没问题。酶切完用碱性磷酸酶处理载体减少自连。菌落PCR时做负对照。
赞一下 回复此楼
5楼2012-10-13 08:41:03
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

j2

木虫 (正式写手)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
fxj1986: 金币+1, 谢谢，正在调整比例 2012-10-13 10:27:03
载体本身也有抗性？还是抗生素失效？
可以考虑增大连接时目的基因的量
赞一下 回复此楼
6楼2012-10-13 09:37:06
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zqp9110

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-10-13 16:31:14
fxj1986: 金币+1, 谢谢建议 2012-10-14 10:23:43
连接时插入片段和载体的比例可能要大一点才能增加连接效率吧。建议连接结束后把连接产物先进行电泳检测，看是否有插入了目的片段的完整载体，每一步都加入质控能减少不必要的工作量。
赞一下 回复此楼
7楼2012-10-13 10:46:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

20083630zhan

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
7楼: Originally posted by zqp9110 at 2012-10-13 10:46:44
连接时插入片段和载体的比例可能要大一点才能增加连接效率吧。建议连接结束后把连接产物先进行电泳检测，看是否有插入了目的片段的完整载体，每一步都加入质控能减少不必要的工作量。

这样也可以吗？连接产物本来就非常少，电泳能看出条带吗？
赞一下 回复此楼
8楼2014-03-03 16:08:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
酶连时载体：片段=1:1.5？？？？我们一般是载体：片段的摩尔数=1:3~1:10.
赞一下 回复此楼
9楼2014-03-03 17:12:03
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 fxj1986 的主题更新
91/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 085600材料与化工，求调剂 +12 won_qii 2026-04-07 12/600 2026-04-12 17:02 by lhj2009
[考研] 290求调剂 +13 luoziheng 2026-04-10 13/650 2026-04-11 23:15 by labixiaoqiao
[考研] 调剂 +6 青灯不负 2026-04-09 6/300 2026-04-11 20:35 by dongdian1
[考研] 求调剂 +10 璃茉一定上岸 2026-04-10 10/500 2026-04-11 13:31 by 1005715100
[考研] 085600材料与化工329分求调剂 +16 叶zilin 2026-04-10 16/800 2026-04-11 11:04 by may_新宇
[考研] 293求调剂 +6 勇远库爱314 2026-04-08 6/300 2026-04-11 10:08 by zhq0425
[考研] 材料类284调剂 +40 想换手机不想解� 2026-04-08 48/2400 2026-04-10 23:28 by 314126402
[考研] 291 求调剂 +29 化工2026届毕业� 2026-04-09 29/1450 2026-04-10 22:55 by dick_runner
[考研] 一志愿0703化学招61最终排名62化学求调剂 +24 招61排名62 2026-04-07 28/1400 2026-04-10 16:15 by yx54321
[考研] 344求调剂 +7 丶风雪夜归人丶 2026-04-09 7/350 2026-04-10 12:05 by pengliang8036
[考研] 085601初试330分找调剂 +10 流心奶黄包l 2026-04-09 10/500 2026-04-10 08:14 by Sammy2
[考研] 材料化工总分334求调剂 +16 Riot2025 2026-04-08 17/850 2026-04-09 20:19 by maddjdld
[考研] 调剂 +19 2261744733 2026-04-08 19/950 2026-04-09 19:11 by vgtyfty
[考研] 368化学求调剂 +13 wwwwabcde 2026-04-07 14/700 2026-04-09 14:47 by heaven_jay
[考研] 一志愿0807 数一英一 313 有没有二轮调剂 +11 emokidd 2026-04-08 12/600 2026-04-09 09:24 by wyf236
[考研] 327求调剂 +12 Xxjc1107. 2026-04-06 12/600 2026-04-08 16:46 by luoyongfeng
[考研] 材料科学与工程320求调剂，080500 +12 黄瓜味薯片 2026-04-06 12/600 2026-04-08 16:26 by luoyongfeng
[考研] 323求调剂 +3 林zlu 2026-04-07 4/200 2026-04-07 23:21 by lbsjt
[考研] 11408 325分 +3 jgtxuxgkx 2026-04-07 3/150 2026-04-07 23:10 by lbsjt
[考研] 求助 +3 卡卡东88 2026-04-06 4/200 2026-04-06 15:28 by going home
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭