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fxj1986

木虫 (正式写手)

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[交流] 酶切酶连转化后单克隆检测不对

自己构建的载体，片段7K左右；片段（3k）通过PCR扩增；电泳后回收进行酶切，酶切条件37℃，3h；再电泳后回收，酶连时载体：片段=1:1.5左右，转化DH5α，16h（氯霉素抗性）平板上单克隆很多；挑取单克隆进行菌落PCR验证（引物为自己设计），电泳结果显示除了目的条带外还有其他条带；对单克隆培养重新提取质粒进行双酶切后，只检测出一条带（与质粒大小基本一致），没有片段的目的条带。几次转化都如此，求分析，求经验！

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1楼 2012-10-12 15:52:01

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faile18

金虫 (小有名气)

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★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
fxj1986: 金币+1, 引物是一样的，正在改变酶切条件 2012-10-13 10:26:32
小丹木木: 金币+3, 光路交流 2012-10-13 16:30:40
小丹木木: 操作失误，不好意思 2012-10-13 16:31:02

有点疑问，也有点小建议：
1. 可以考虑蓝白斑筛选，初步滤掉空载体，白色克隆PCR检测，（这里有个疑问，你PCR验证时说引物自己设计，不知道你这对引物与你之前PCR扩增3K片段时是否一样，如果不一样可以考虑用那对引物扩增来检测一下）。
2. 确定下质粒双酶切体系是否兼容，比如buffer，酶用量等都会有影响。
3. 你的载体自身是否work？
祝好运。