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windycui

铁杆木虫 (正式写手)

[交流] PCR实验结果与酶用量有关吗？ 已有9人参与

不知道大家有没有遇到过这样的情况，我用的是宝生物的普通Taq酶，25微升体系，按照50微升体系减半后扩增出很浅的条带，只把酶用量加倍后无条带，但是引物二聚体比以前亮多了，PCR结果跟酶用量有关吗？
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1楼 2013-07-12 16:45:49
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匿名

用户注销 (著名写手)
★
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2楼2013-07-13 23:44:57
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肃清华书

金虫 (小有名气)
★ ★ ★
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gyesang: 金币+2, 正解！ 2013-07-14 14:52:28
酶加多了以后会导致非特异性扩增增多，所以一般加1U的酶就够用了
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3楼2013-07-14 08:50:53
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ml1294

银虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
应该是没关系， 退火温度 循环数调整一下 或是模板
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4楼2013-07-14 08:58:09
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figmeiling

新虫 (初入文坛)
★ ★ ★
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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-07-14 14:52:41
25ul的体系只需要1ul的酶，加多了也无用。但PCR结果与退火温度与模板有很大的关系。尤其是退火温度要找准，不然就扩增不出所需要的目的条带。
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5楼2013-07-14 14:25:08
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qzaqz

金虫 (正式写手)
★ ★
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kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-07-15 20:18:43
我用的也是宝生物的普通酶，之前也是减半做PCR，扩不出来，后来咨询了他们的技术员，他们告诉我不论做多大体系，都用1U的酶，其它的按比例加。同时预变性时间不用5min，2分就可以。后来就再没出现扩不出来的情况了
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6楼2013-07-14 14:52:19
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windycui

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 肃清华书 at 2013-07-14 08:50:53
酶加多了以后会导致非特异性扩增增多，所以一般加1U的酶就够用了

可是安装你这个说法，一开始我加的酶不够1u，有条带，后来加的比1u多了，就没有条带了
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7楼2013-07-15 08:25:38
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windycui

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by basler at 2013-07-13 23:44:57
我不知道你为什么还要加倍，酶在反应体系中本来就是足量或过量的！

因为领导有要求
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8楼2013-07-15 08:25:57
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windycui

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by qzaqz at 2013-07-14 14:52:19
我用的也是宝生物的普通酶，之前也是减半做PCR，扩不出来，后来咨询了他们的技术员，他们告诉我不论做多大体系，都用1U的酶，其它的按比例加。同时预变性时间不用5min，2分就可以。后来就再没出现扩不出来的情况了

我一开始加的酶不足1u，有条带，加了1u多了，就没有条带了，都是引物二聚体了
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9楼2013-07-15 08:26:49
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qzaqz

金虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
扩增片段多长？如果较长要增加dNTP的量,不过一般的都适合。 退火温度调低再试下，或做个温度梯度
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10楼2013-07-15 12:51:02
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