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windycui

铁杆木虫 (正式写手)

[交流] PCR实验结果与酶用量有关吗? 已有9人参与

不知道大家有没有遇到过这样的情况,我用的是宝生物的普通Taq酶,25微升体系,按照50微升体系减半后扩增出很浅的条带,只把酶用量加倍后无条带,但是引物二聚体比以前亮多了,PCR结果跟酶用量有关吗?
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匿名

用户注销 (著名写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
本帖仅楼主可见
2楼2013-07-13 23:44:57
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肃清华书

金虫 (小有名气)

★ ★ ★
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gyesang: 金币+2, 正解! 2013-07-14 14:52:28
酶加多了以后会导致非特异性扩增增多,所以一般加1U的酶就够用了
3楼2013-07-14 08:50:53
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ml1294

银虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
应该是没关系, 退火温度 循环数调整一下 或是模板
4楼2013-07-14 08:58:09
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figmeiling

新虫 (初入文坛)

★ ★ ★
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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2013-07-14 14:52:41
25ul的体系只需要1ul的酶,加多了也无用。但PCR结果与退火温度与模板有很大的关系。尤其是退火温度要找准,不然就扩增不出所需要的目的条带。
5楼2013-07-14 14:25:08
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qzaqz

金虫 (正式写手)

★ ★
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kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-07-15 20:18:43
我用的也是宝生物的普通酶,之前也是减半做PCR,扩不出来,后来咨询了他们的技术员,他们告诉我不论做多大体系,都用1U的酶,其它的按比例加。同时预变性时间不用5min,2分就可以。后来就再没出现扩不出来的情况了
6楼2013-07-14 14:52:19
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windycui

铁杆木虫 (正式写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 肃清华书 at 2013-07-14 08:50:53
酶加多了以后会导致非特异性扩增增多,所以一般加1U的酶就够用了

可是安装你这个说法,一开始我加的酶不够1u,有条带,后来加的比1u多了,就没有条带了
7楼2013-07-15 08:25:38
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windycui

铁杆木虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by basler at 2013-07-13 23:44:57
我不知道你为什么还要加倍,酶在反应体系中本来就是足量或过量的!

因为领导有要求
8楼2013-07-15 08:25:57
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windycui

铁杆木虫 (正式写手)

引用回帖:
6楼: Originally posted by qzaqz at 2013-07-14 14:52:19
我用的也是宝生物的普通酶,之前也是减半做PCR,扩不出来,后来咨询了他们的技术员,他们告诉我不论做多大体系,都用1U的酶,其它的按比例加。同时预变性时间不用5min,2分就可以。后来就再没出现扩不出来的情况了

我一开始加的酶不足1u,有条带,加了1u多了,就没有条带了,都是引物二聚体了
9楼2013-07-15 08:26:49
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qzaqz

金虫 (正式写手)


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扩增片段多长?如果较长要增加dNTP的量,不过一般的都适合。 退火温度调低再试下,或做个温度梯度
10楼2013-07-15 12:51:02
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