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windycui

铁杆木虫 (正式写手)

引用回帖:
10楼: Originally posted by qzaqz at 2013-07-15 12:51:02
扩增片段多长?如果较长要增加dNTP的量,不过一般的都适合。 退火温度调低再试下,或做个温度梯度

扩增2000bp片段,退火温度是原来有条带的温度,所以没有变
11楼2013-07-15 16:13:50
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明清远

木虫 (正式写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
加多了,甘油浓度也高了,这些都是不利于扩增的,有时候为了减少拖尾,还适当减少呢
12楼2013-07-15 16:31:05
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windycui

铁杆木虫 (正式写手)

引用回帖:
12楼: Originally posted by 明清远 at 2013-07-15 16:31:05
加多了,甘油浓度也高了,这些都是不利于扩增的,有时候为了减少拖尾,还适当减少呢

嗯,自从酶用量上去了以后,引物二聚体那叫一个亮啊
13楼2013-07-15 16:35:11
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nxguojunxian

新虫 (初入文坛)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
不用把酶加量,主要检查模板质量和引物设计是否合理
14楼2013-07-15 16:40:22
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老夏853

铁杆木虫 (著名写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
13楼: Originally posted by windycui at 2013-07-15 16:35:11
嗯,自从酶用量上去了以后,引物二聚体那叫一个亮啊...

问题应该不是酶的问题。 模板DNA质量如何,其中目的基因丰度怎么样。
还有退火温度和退火时间等详细条件能说下不?》
15楼2013-07-15 17:10:47
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windycui

铁杆木虫 (正式写手)

引用回帖:
15楼: Originally posted by 老夏853 at 2013-07-15 17:10:47
问题应该不是酶的问题。 模板DNA质量如何,其中目的基因丰度怎么样。
还有退火温度和退火时间等详细条件能说下不?》...

模板DNA的质量不知,是从别人那要的,其他情况一概不清楚,退火温度55度,退火时间30s,延伸2min
16楼2013-07-15 17:50:31
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shanguangm11

木虫 (初入文坛)

★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-07-15 20:19:08
引用回帖:
9楼: Originally posted by windycui at 2013-07-15 08:26:49
我一开始加的酶不足1u,有条带,加了1u多了,就没有条带了,都是引物二聚体了...

因为甘油不易上冻,所以酶的保护剂里面一般有甘油,同时,5%浓度的甘油可提高PCR的反应效率,而超过20%的甘油就抑制PCR扩增了…而且一般PCR体系中酶的量都是过量的…所以,加多了没用…反而有害…
17楼2013-07-15 18:44:46
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老夏853

铁杆木虫 (著名写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
16楼: Originally posted by windycui at 2013-07-15 17:50:31
模板DNA的质量不知,是从别人那要的,其他情况一概不清楚,退火温度55度,退火时间30s,延伸2min...

找个阳性对照DNA。我觉得可能是因为模板里面确实目的片段含量比较少。
18楼2013-07-15 20:58:31
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windycui

铁杆木虫 (正式写手)

引用回帖:
18楼: Originally posted by 老夏853 at 2013-07-15 20:58:31
找个阳性对照DNA。我觉得可能是因为模板里面确实目的片段含量比较少。...

您好,您所指的阳性对照DNA是指含目的片段较多的模板还是用原来模板扩内参基因呢?以前没有做过阳性对照啊
19楼2013-07-16 09:27:37
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老夏853

铁杆木虫 (著名写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
19楼: Originally posted by windycui at 2013-07-16 09:27:37
您好,您所指的阳性对照DNA是指含目的片段较多的模板还是用原来模板扩内参基因呢?以前没有做过阳性对照啊...

阳性 就是 保证能扩增出来正确条带的样品。 我怀疑可能是你的样品DNA的问题。
20楼2013-07-16 11:15:48
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