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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR实验结果与酶用量有关吗？
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windycui

铁杆木虫 (正式写手)
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10楼: Originally posted by qzaqz at 2013-07-15 12:51:02
扩增片段多长？如果较长要增加dNTP的量,不过一般的都适合。 退火温度调低再试下，或做个温度梯度

扩增2000bp片段，退火温度是原来有条带的温度，所以没有变
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11楼2013-07-15 16:13:50
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明清远

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
加多了，甘油浓度也高了，这些都是不利于扩增的，有时候为了减少拖尾，还适当减少呢
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12楼2013-07-15 16:31:05
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windycui

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
12楼: Originally posted by 明清远 at 2013-07-15 16:31:05
加多了，甘油浓度也高了，这些都是不利于扩增的，有时候为了减少拖尾，还适当减少呢

嗯，自从酶用量上去了以后，引物二聚体那叫一个亮啊
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13楼2013-07-15 16:35:11
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nxguojunxian

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
不用把酶加量，主要检查模板质量和引物设计是否合理
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14楼2013-07-15 16:40:22
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老夏853

铁杆木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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13楼: Originally posted by windycui at 2013-07-15 16:35:11
嗯，自从酶用量上去了以后，引物二聚体那叫一个亮啊...

问题应该不是酶的问题。 模板DNA质量如何,其中目的基因丰度怎么样。
还有退火温度和退火时间等详细条件能说下不？》
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15楼2013-07-15 17:10:47
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windycui

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
15楼: Originally posted by 老夏853 at 2013-07-15 17:10:47
问题应该不是酶的问题。 模板DNA质量如何,其中目的基因丰度怎么样。
还有退火温度和退火时间等详细条件能说下不？》...

模板DNA的质量不知，是从别人那要的，其他情况一概不清楚，退火温度55度，退火时间30s，延伸2min
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16楼2013-07-15 17:50:31
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shanguangm11

木虫 (初入文坛)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-07-15 20:19:08
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9楼: Originally posted by windycui at 2013-07-15 08:26:49
我一开始加的酶不足1u，有条带，加了1u多了，就没有条带了，都是引物二聚体了...

因为甘油不易上冻，所以酶的保护剂里面一般有甘油，同时，5%浓度的甘油可提高PCR的反应效率，而超过20%的甘油就抑制PCR扩增了…而且一般PCR体系中酶的量都是过量的…所以，加多了没用…反而有害…
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17楼2013-07-15 18:44:46
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老夏853

铁杆木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
16楼: Originally posted by windycui at 2013-07-15 17:50:31
模板DNA的质量不知，是从别人那要的，其他情况一概不清楚，退火温度55度，退火时间30s，延伸2min...

找个阳性对照DNA。我觉得可能是因为模板里面确实目的片段含量比较少。
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18楼2013-07-15 20:58:31
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windycui

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
18楼: Originally posted by 老夏853 at 2013-07-15 20:58:31
找个阳性对照DNA。我觉得可能是因为模板里面确实目的片段含量比较少。...

您好,您所指的阳性对照DNA是指含目的片段较多的模板还是用原来模板扩内参基因呢？以前没有做过阳性对照啊
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19楼2013-07-16 09:27:37
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老夏853

铁杆木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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19楼: Originally posted by windycui at 2013-07-16 09:27:37
您好,您所指的阳性对照DNA是指含目的片段较多的模板还是用原来模板扩内参基因呢？以前没有做过阳性对照啊...

阳性 就是 保证能扩增出来正确条带的样品。 我怀疑可能是你的样品DNA的问题。
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20楼2013-07-16 11:15:48
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