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暗夜懒猫

银虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】PCR电泳结果疑问

试验中用pmd-19载体连接2kb的目的片段，转入感受态大肠杆菌，菌液长起后涂带有氨苄抗性的LB板，有菌落长出，挑取菌落接于带氨苄抗性的液体LB培养基中，待菌长起后取菌液直接做PCR扩增目的条带，但电泳图却显示无目的条带，有的只是200bp的非目的条带，不知原因何在，难道在抗性板上长出的都是假阳性菌，请高人指点！
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1楼 2011-01-08 15:29:32
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duanming123

木虫 (正式写手)
★
最爱花诗雨(金币+1):鼓励交流 2011-01-08 15:56:20
有可能没连上，筛菌PCR做的没问题吧。不行再做一次吧。
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2楼2011-01-08 15:55:09
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srlee

铁杆木虫 (小有名气)
★
dhd997(金币+1):鼓励交流 2011-01-10 09:08:51
PCR验证也不一定就是很准的，建议提质粒或再进一步酶切验证一下看！
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3楼2011-01-08 17:49:22
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xuqingchun33

银虫 (小有名气)
★
silicare(金币+1):谢谢参与 2011-01-10 11:52:24
是氨苄抗性吗，再者氨苄的浓度，及其实效，是否失效
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5楼2011-01-10 09:23:13
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天使托

专家顾问 (职业作家)
★
silicare(金币+1):谢谢参与 2011-01-10 11:52:30
你可以在涂布长出来的单克隆中挑出来几个重新划到相应浓度抗生素的板子上，然后直接用菌体当做模板做pcr验证！
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6楼2011-01-10 10:41:24
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暗夜懒猫

银虫 (小有名气)

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引用回帖:
Originally posted by 天使托 at 2011-01-10 10:41:24:
你可以在涂布长出来的单克隆中挑出来几个重新划到相应浓度抗生素的板子上，然后直接用菌体当做模板做pcr验证！

不太明白你所说的，直接用菌体PCR，直接从板上挑的菌吗？不用转接到液体培养基中吗？
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7楼2011-01-13 11:03:08
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天使托

专家顾问 (职业作家)
★
dhd997(金币+1):谢谢交流 2011-01-13 15:09:59
引用回帖:
Originally posted by 暗夜懒猫 at 2011-01-13 11:03:08:

不太明白你所说的，直接用菌体PCR，直接从板上挑的菌吗？不用转接到液体培养基中吗？

就是挑取少量菌体至pcr事先加入10or20ul去离子水的小管中，然后pcr仪中裂解~裂解出来的就可以当模板用了！
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8楼2011-01-13 11:12:42
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shaquila

金虫 (正式写手)
★
dhd997(金币+1):谢谢交流 2011-01-13 15:10:12
lz，如果你的insert浓度太低，可以试试降低plasmid浓度～～
我用takara 18t，10ul体系推荐用量为1ul，我一般加0.3到0.5，连接时间半小时，假阳性明显降低，这个试剂盒有一定几率的自连，而且和载体浓度有关，之前用1ul时候，挑了30个克隆才3个，后来用0.3，100％都是插入的～
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9楼2011-01-13 11:18:49
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暗夜懒猫

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 天使托 at 2011-01-13 11:12:42:


就是挑取少量菌体至pcr事先加入10or20ul去离子水的小管中，然后pcr仪中裂解~裂解出来的就可以当模板用了！

倒是没有这样挑过，可以避免假阳性吗? 如果你板上的菌为假阳性直接跳到PCR体系中电泳不也是不出条带吗？
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10楼2011-01-13 14:22:50
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暗夜懒猫

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by shaquila at 2011-01-13 11:18:49:
lz，如果你的insert浓度太低，可以试试降低plasmid浓度～～
我用takara 18t，10ul体系推荐用量为1ul，我一般加0.3到0.5，连接时间半小时，假阳性明显降低，这个试剂盒有一定几率的自连，而且和载体浓度有关，之前 ...

我用的浓度不很大啊，0.5，就是连接时间有点长，有十个小时左右了。不是一般都说连接过夜嘛。
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11楼2011-01-13 14:26:21
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shaquila

金虫 (正式写手)
暗夜懒猫(金币+2): 2011-01-13 14:53:27
引用回帖:
Originally posted by 暗夜懒猫 at 2011-01-13 14:26:21:

我用的浓度不很大啊，0.5，就是连接时间有点长，有十个小时左右了。不是一般都说连接过夜嘛。

T载体按说明书说半小时足够了，而且在室温或冰箱里也能连接哦，所以，效率太高也不好～～～
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12楼2011-01-13 14:38:00
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天使托

专家顾问 (职业作家)
暗夜懒猫(金币+3): 2011-01-13 14:53:13
引用回帖:
Originally posted by 暗夜懒猫 at 2011-01-13 14:22:50:

倒是没有这样挑过，可以避免假阳性吗? 如果你板上的菌为假阳性直接跳到PCR体系中电泳不也是不出条带吗？

假阳性是会有的，但是你可以多挑一些单克隆到板子上，然后画出来菌，直接用菌裂解了当模板用啊，pcr没有条带就可以排除了！
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13楼2011-01-13 14:47:55
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shaquila

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
如果是假阳性，多挑几个克隆，挑菌体pcr也行，但不会影响结果，而且如果不保菌那也没意义，如果不想重做转化，就在挑至少20个克隆试试。下次做的时候注意可以不用加水，全部加insert，还是不行换试剂盒吧，我之前用BIOTECK的T载体(仿TAKARA的)，阳性率100%，这和酶以及体系有关系。之前做过对照实验，用不同浓度18t不加片段进行连接转化，自连频率和载体浓度有关
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14楼2011-01-13 18:19:40
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lijunj4楼
2011-01-09 23:09   回复  
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