应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】PCR电泳结果疑问
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
141/1返回列表
查看: 1927  |  回复: 13
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

暗夜懒猫

银虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】PCR电泳结果疑问

试验中用pmd-19载体连接2kb的目的片段，转入感受态大肠杆菌，菌液长起后涂带有氨苄抗性的LB板，有菌落长出，挑取菌落接于带氨苄抗性的液体LB培养基中，待菌长起后取菌液直接做PCR扩增目的条带，但电泳图却显示无目的条带，有的只是200bp的非目的条带，不知原因何在，难道在抗性板上长出的都是假阳性菌，请高人指点！
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:

» 抢金币啦！回帖就可以得到:

查看全部散金贴
1楼 2011-01-08 15:29:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

duanming123

木虫 (正式写手)
★
最爱花诗雨(金币+1):鼓励交流 2011-01-08 15:56:20
有可能没连上，筛菌PCR做的没问题吧。不行再做一次吧。
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2011-01-08 15:55:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

srlee

铁杆木虫 (小有名气)
★
dhd997(金币+1):鼓励交流 2011-01-10 09:08:51
PCR验证也不一定就是很准的，建议提质粒或再进一步酶切验证一下看！
赞一下(1人) 回复此楼
3楼2011-01-08 17:49:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xuqingchun33

银虫 (小有名气)
★
silicare(金币+1):谢谢参与 2011-01-10 11:52:24
是氨苄抗性吗，再者氨苄的浓度，及其实效，是否失效
赞一下(1人) 回复此楼
5楼2011-01-10 09:23:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

天使托

专家顾问 (职业作家)
★
silicare(金币+1):谢谢参与 2011-01-10 11:52:30
你可以在涂布长出来的单克隆中挑出来几个重新划到相应浓度抗生素的板子上，然后直接用菌体当做模板做pcr验证！
赞一下(1人) 回复此楼
6楼2011-01-10 10:41:24
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

暗夜懒猫

银虫 (小有名气)

回复

引用回帖:
Originally posted by 天使托 at 2011-01-10 10:41:24:
你可以在涂布长出来的单克隆中挑出来几个重新划到相应浓度抗生素的板子上，然后直接用菌体当做模板做pcr验证！

不太明白你所说的，直接用菌体PCR，直接从板上挑的菌吗？不用转接到液体培养基中吗？
赞一下 回复此楼
7楼2011-01-13 11:03:08
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

天使托

专家顾问 (职业作家)
★
dhd997(金币+1):谢谢交流 2011-01-13 15:09:59
引用回帖:
Originally posted by 暗夜懒猫 at 2011-01-13 11:03:08:

不太明白你所说的，直接用菌体PCR，直接从板上挑的菌吗？不用转接到液体培养基中吗？

就是挑取少量菌体至pcr事先加入10or20ul去离子水的小管中，然后pcr仪中裂解~裂解出来的就可以当模板用了！
赞一下(1人) 回复此楼
8楼2011-01-13 11:12:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

shaquila

金虫 (正式写手)
★
dhd997(金币+1):谢谢交流 2011-01-13 15:10:12
lz，如果你的insert浓度太低，可以试试降低plasmid浓度～～
我用takara 18t，10ul体系推荐用量为1ul，我一般加0.3到0.5，连接时间半小时，假阳性明显降低，这个试剂盒有一定几率的自连，而且和载体浓度有关，之前用1ul时候，挑了30个克隆才3个，后来用0.3，100％都是插入的～
赞一下(1人) 回复此楼
9楼2011-01-13 11:18:49
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

暗夜懒猫

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 天使托 at 2011-01-13 11:12:42:


就是挑取少量菌体至pcr事先加入10or20ul去离子水的小管中，然后pcr仪中裂解~裂解出来的就可以当模板用了！

倒是没有这样挑过，可以避免假阳性吗? 如果你板上的菌为假阳性直接跳到PCR体系中电泳不也是不出条带吗？
赞一下 回复此楼
10楼2011-01-13 14:22:50
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

暗夜懒猫

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by shaquila at 2011-01-13 11:18:49:
lz，如果你的insert浓度太低，可以试试降低plasmid浓度～～
我用takara 18t，10ul体系推荐用量为1ul，我一般加0.3到0.5，连接时间半小时，假阳性明显降低，这个试剂盒有一定几率的自连，而且和载体浓度有关，之前 ...

我用的浓度不很大啊，0.5，就是连接时间有点长，有十个小时左右了。不是一般都说连接过夜嘛。
赞一下 回复此楼
11楼2011-01-13 14:26:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

shaquila

金虫 (正式写手)
暗夜懒猫(金币+2): 2011-01-13 14:53:27
引用回帖:
Originally posted by 暗夜懒猫 at 2011-01-13 14:26:21:

我用的浓度不很大啊，0.5，就是连接时间有点长，有十个小时左右了。不是一般都说连接过夜嘛。

T载体按说明书说半小时足够了，而且在室温或冰箱里也能连接哦，所以，效率太高也不好～～～
赞一下 回复此楼
12楼2011-01-13 14:38:00
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

天使托

专家顾问 (职业作家)
暗夜懒猫(金币+3): 2011-01-13 14:53:13
引用回帖:
Originally posted by 暗夜懒猫 at 2011-01-13 14:22:50:

倒是没有这样挑过，可以避免假阳性吗? 如果你板上的菌为假阳性直接跳到PCR体系中电泳不也是不出条带吗？

假阳性是会有的，但是你可以多挑一些单克隆到板子上，然后画出来菌，直接用菌裂解了当模板用啊，pcr没有条带就可以排除了！
赞一下 回复此楼
13楼2011-01-13 14:47:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

shaquila

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
如果是假阳性，多挑几个克隆，挑菌体pcr也行，但不会影响结果，而且如果不保菌那也没意义，如果不想重做转化，就在挑至少20个克隆试试。下次做的时候注意可以不用加水，全部加insert，还是不行换试剂盒吧，我之前用BIOTECK的T载体(仿TAKARA的)，阳性率100%，这和酶以及体系有关系。之前做过对照实验，用不同浓度18t不加片段进行连接转化，自连频率和载体浓度有关
赞一下(1人) 回复此楼
14楼2011-01-13 18:19:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
简单回复
lijunj4楼
2011-01-09 23:09   回复  
相关版块跳转 我要订阅楼主 暗夜懒猫 的主题更新
141/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 一志愿211，化学学硕，310分，本科重点双非，求调剂 +12 努力奋斗112 2026-04-04 12/600 2026-04-06 06:33 by houyaoxu
[考研] 材料专硕283求调剂 +14 试试看呗 2026-04-04 15/750 2026-04-05 19:21 by jkddd
[考研] 288求调剂 一志愿哈工大 材料与化工 +13 洛神哥哥 2026-04-03 13/650 2026-04-05 17:27 by zzx2138
[考研] 考研调剂 +3 mcbbc 2026-04-04 3/150 2026-04-05 10:03 by barlinike
[考研] 070300化学学硕311分求调剂 +10 梁富贵险中求 2026-04-04 12/600 2026-04-05 09:37 by guoweigw
[考研] 材料调剂 +12 一样YWY 2026-04-04 12/600 2026-04-05 08:24 by 544594351
[考研] 调剂 +9 19945159693 2026-04-03 10/500 2026-04-04 20:16 by dongzh2009
[考研] 085602 找调剂 +4 逆时针快乐 2026-04-02 4/200 2026-04-04 19:32 by 蓝云思雨
[考研] 348分环境工程·调剂 +10 吴彦祖24k 2026-04-03 11/550 2026-04-04 14:19 by 无际的草原
[考研] 266求调剂 +18 阳阳哇塞 2026-04-01 18/900 2026-04-03 18:38 by zllcz
[考研] 抱歉 +5 田洪有 2026-03-30 5/250 2026-04-03 10:24 by linyelide
[考研] 273求调剂 +20 李芷新1 2026-03-31 20/1000 2026-04-03 09:58 by linyelide
[考研] 一志愿山东大学化学与化工学院材料与化工专硕，360分求调剂 +4 不愿透露姓名的� 2026-04-02 4/200 2026-04-03 09:29 by 遗忘消失的灆
[考研] 一志愿山东大学，085600，344 +7 魏子per 2026-04-02 8/400 2026-04-02 21:12 by 百灵童888
[考研] 调剂 +3 好好读书。 2026-04-01 6/300 2026-04-02 15:49 by liumengping
[考研] 285求调剂 +11 AZMK 2026-04-01 11/550 2026-04-01 22:40 by peike
[考研] 求调剂 +4 DADA怪 2026-03-31 4/200 2026-04-01 14:30 by ZXlzxl0425
[考研] 一志愿中海洋材料357 +4 麦恩莉. 2026-03-30 4/200 2026-03-31 14:35 by 记事本2026
[考研] 生物考研337分求调剂 +4 cgxin 2026-03-30 6/300 2026-03-31 14:18 by 记事本2026
[考研] 297 地理学070500 复试求调剂 +3 小圆圈圈ooo 2026-03-30 3/150 2026-03-30 21:05 by 余震yz
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭