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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】PCR电泳结果疑问
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暗夜懒猫

银虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】PCR电泳结果疑问

试验中用pmd-19载体连接2kb的目的片段，转入感受态大肠杆菌，菌液长起后涂带有氨苄抗性的LB板，有菌落长出，挑取菌落接于带氨苄抗性的液体LB培养基中，待菌长起后取菌液直接做PCR扩增目的条带，但电泳图却显示无目的条带，有的只是200bp的非目的条带，不知原因何在，难道在抗性板上长出的都是假阳性菌，请高人指点！
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1楼 2011-01-08 15:29:32
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暗夜懒猫

银虫 (小有名气)

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引用回帖:
Originally posted by 天使托 at 2011-01-10 10:41:24:
你可以在涂布长出来的单克隆中挑出来几个重新划到相应浓度抗生素的板子上，然后直接用菌体当做模板做pcr验证！

不太明白你所说的，直接用菌体PCR，直接从板上挑的菌吗？不用转接到液体培养基中吗？
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7楼2011-01-13 11:03:08
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暗夜懒猫

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 天使托 at 2011-01-13 11:12:42:


就是挑取少量菌体至pcr事先加入10or20ul去离子水的小管中，然后pcr仪中裂解~裂解出来的就可以当模板用了！

倒是没有这样挑过，可以避免假阳性吗? 如果你板上的菌为假阳性直接跳到PCR体系中电泳不也是不出条带吗？
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10楼2011-01-13 14:22:50
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暗夜懒猫

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by shaquila at 2011-01-13 11:18:49:
lz，如果你的insert浓度太低，可以试试降低plasmid浓度～～
我用takara 18t，10ul体系推荐用量为1ul，我一般加0.3到0.5，连接时间半小时，假阳性明显降低，这个试剂盒有一定几率的自连，而且和载体浓度有关，之前 ...

我用的浓度不很大啊，0.5，就是连接时间有点长，有十个小时左右了。不是一般都说连接过夜嘛。
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11楼2011-01-13 14:26:21
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