应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

CyRhmU.jpeg
小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR重复不出来
81/1返回列表
查看: 1526  |  回复: 7
只看楼主@他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

echochen1017

新虫 (初入文坛)

[求助] PCR重复不出来

之前在3月份PCR除了结果，并测序，现在重复，已经重复5天，没有任何条带，调高、调低模板浓度，并且在冰上加样，也没有目的条带，低浓度样品在500bp左右出现非特异性条带，请教这是什么情况呢？
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼2013-06-08 16:21:05
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-06-09 22:04:32
你的PCR出现非特异性扩增带和可重复性低本质就是你的PCR的专一性不够。
PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带 与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、 或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶 则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。
其对策有：首先可以调整镁离子的浓度， 由5.0mmol/L起以0.05mmol/L为单位逐渐下降至1.0mmol/L，降低镁离子的浓度无效的话，也可以提高镁离子浓度，最高不超过10.0mmol/L.调整引物浓度（你的非特异性扩增多，因此应适当降低引物浓度），适当增加模板量，减少循环次数。减低酶量或调换另一来源的酶。适当提高退火温度。
使用热启动的PCR.可用石蜡隔离方式：先放引物、模板、缓冲溶液（以上称为A液）入PCR管，然后加入固体石蜡，75度水浴PCR管5分钟，目视石蜡完全融化后拿PCR管出水浴锅室温下竖直放置约15分钟，待石蜡重新凝固为固体层后，在石蜡层上加入聚合酶、dNTP、MgCl2、缓冲溶液（以上称为B液），也就是使固体石蜡层隔离A液与B液在PCR管的上下两层。反应开始后，石蜡再度熔化，反应体系形成。每种调整均可以分梯度进行。
一般商用的酶制剂里都还有甘油，酶的用量较大时最好是事先超滤或者透析去除一些甘油。
加入0.01%的BSA，白明胶或者Tritom X-100.也有助于提高PCR反应的专一性和可重复性。以上都不行则要重新设计引物。
另外，时机最好用新鲜的，操作注意防止污染。
赞一下 回复此楼
2楼2013-06-08 17:25:06
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhoulubin

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-06-09 22:05:04
二楼理论很扎实，可惜过于复杂
建议：
1.将测序样品要回，拿返回的样品做PCR；
2.换酶，重新稀释引物，换模板（重提DNA或反转录）；
3.现在有很多预混的酶，都很好用的，至于Mg2+浓度，石蜡，BSA这些东西都是很落后的措施，现在PCR技术和试剂都很成熟，没必要自己花时间精力去摸索。
赞一下 回复此楼
每个年龄都有其最应该做的事，但只有过了那个年龄自己才知道
3楼2013-06-09 09:36:20
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by zhoulubin at 2013-06-09 09:36:20
二楼理论很扎实，可惜过于复杂
建议：
1.将测序样品要回，拿返回的样品做PCR；
2.换酶，重新稀释引物，换模板（重提DNA或反转录）；
3.现在有很多预混的酶，都很好用的，至于Mg2+浓度，石蜡，BSA这些东西都是很 ...

就是有混装好的酶就不需要自己选择实验条件和摸索了！如果是这样为什么版里还有大量的PCR的问题！

别的不说：光是稀释引物就没有定量化标准吗！？那个世纪公司能配出任何条件下都能适用的PCR试剂！！！？？？
赞一下 回复此楼
4楼2013-06-10 01:46:57
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by zhoulubin at 2013-06-09 09:36:20
二楼理论很扎实，可惜过于复杂
建议：
1.将测序样品要回，拿返回的样品做PCR；
2.换酶，重新稀释引物，换模板（重提DNA或反转录）；
3.现在有很多预混的酶，都很好用的，至于Mg2+浓度，石蜡，BSA这些东西都是很 ...

既然你那么有能耐！！！那么请你举出一种完全不用镁离子且能够适用各种条件下的PCR试剂出来让我们也听听！！！！
赞一下 回复此楼
5楼2013-06-10 01:49:31
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

starseacow

专家顾问 (职业作家)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 凌波丽 at 2013-06-10 01:49:31
既然你那么有能耐！！！那么请你举出一种完全不用镁离子且能够适用各种条件下的PCR试剂出来让我们也听听！！！！...

3楼虫友也是出于好意提供建议，你也不用反应这么强烈吧

你提供的建议很全面，但有时候，有些虫友只是需要尽快获得结果，可能不需要钻的那么深，那么首先从三楼建议的方案出发就挺好。有些公司的预混产品就很不错，我在做一些拟南芥相关工作，比较过一些高保真酶，像Q5，Phusion的预混酶几乎可以满足所有实验需要，只是有时候调整一下退火温度。
赞一下(1人) 回复此楼
植物生理群69993869，为避免广告，申请加入请提供木虫昵称，院校及专业信息
6楼2013-06-10 03:57:57
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhoulubin

银虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by starseacow at 2013-06-10 03:57:57
3楼虫友也是出于好意提供建议，你也不用反应这么强烈吧

你提供的建议很全面，但有时候，有些虫友只是需要尽快获得结果，可能不需要钻的那么深，那么首先从三楼建议的方案出发就挺好。有些公司的预混产品 ...


二楼有点像我老板
赞一下 回复此楼
每个年龄都有其最应该做的事，但只有过了那个年龄自己才知道
7楼2013-06-10 16:06:59
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

learningying

铁杆木虫 (著名写手)
我现在和你的情况一样的。。理解下啦！现在做出来了吗？
赞一下 回复此楼
加油，天道酬勤
8楼2014-10-27 19:54:48
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 echochen1017 的主题更新
81/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭