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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » RCR自己怎么都做不出来，但是同样条件下师哥帮着做了，却出来了，求助原因
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maomao809920

金虫 (小有名气)

[求助] RCR自己怎么都做不出来，但是同样条件下师哥帮着做了，却出来了，求助原因

最近在做PCR，新手一枚，跨专业到生物化学专业。。
师哥指导下做了PCR，之后跑了电泳，但是什么都没有。
然后师哥自己做了一遍（同样的药品、仪器、体系），电泳后就有条带了。。
之后自己又做了一遍，依旧没有，很桑心。想知道为什么。。

分析了一下，觉得应该是自己使用移液枪加样的不规范导致的，在加样的时候应该注意什么，是不是每次加样的时候，枪头都要深入至小离心管管底？

求各位大侠指导了，是不是我操作有问题。。

先谢谢了！
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1楼2011-07-17 16:05:42
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green1223

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

maomao809920(金币+2): 谢谢~ 2011-07-17 21:51:31
加DNA模板时，把枪头深入底部 吸打几次再加入就没问题了
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2楼2011-07-17 19:00:41
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dhd997

荣誉版主 (文坛精英)

自由人，我型我秀！

优秀版主

【答案】应助回帖

量少，不会没加进去吧
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人生不过几十年，成败荣辱都在天，是非恩怨莫在意，健康快乐最值钱，自古人间苦无边，看得高远境如仙，愿你不为凡事恼，轻松快乐每一天。
3楼2011-07-17 20:06:51
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maomao809920

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by dhd997 at 2011-07-17 20:06:51:
量少，不会没加进去吧

我觉得也是。。但是都离心了，应该也会沉淀下去吧。。。
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4楼2011-07-17 21:53:39
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maomao809920

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by green1223 at 2011-07-17 19:00:41:
加DNA模板时，把枪头深入底部 吸打几次再加入就没问题了

还要什么要注意的没？呵呵呵~~求教
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5楼2011-07-17 21:58:12
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zcqcau

铁杆木虫 (著名写手)
★ ★
dhd997(金币+2): 谢谢交流 2011-07-18 12:46:23
应该说PCR是最简单的操作了，应该说这个的确有不稳定性因素和运气在里面，但是我觉得主要还是熟能生巧，现在我们都用PCR Mixture 更加简单了，希望你能找点相关试剂盒 PCR mixture 相信能给你带来不少的方便
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将有能量帮助他人作为自己的人生追求！
6楼2011-07-18 00:36:48
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+5): good 2011-07-18 12:46:32
dhd997(EPI+1): 没仔细看 2011-07-18 12:47:24
新手呀，没有做出来很正常的；慢慢来就可以很随意的；
PCR这个东西呢，首先你得先搞清楚原理是什么，就是体系中各个样品是干什么的，这个必须清楚，不要等做过很多PCR了，才发现里面什么东西是干什么的都不知道，就悲催了；

首先呢，体系呢，小到10ul，大到100--200都有的，不同目的，不一样的体系；
体系中有什么呢？去离子水 模板 引物（sense antisense） 酶 Buffer dNTP 一般就这六种，有时候还会添加甘油，DMSO KCL；

还有就是操作的时候，一定要细心认真，因为加的量都比较小，所以要用准确一点的移液枪，稍有不慎就会多加或者少加，所以这一步很重要滴；

下来就是程序的设计了，主要需要注意的是退火温度和延伸时间的选择了，不同目的不一样的，慢慢做就会很随意的。

加油！祝福ing
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
7楼2011-07-18 12:45:06
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fzsw706

新虫 (初入文坛)
★
西瓜(金币+1): 鼓励 2011-07-18 17:15:30
所有冷冻试剂解冻后需混匀加入
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8楼2011-07-18 14:13:15
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吴远耀

金虫 (小有名气)
我也跟楼主一样的情况，同学习了。
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9楼2011-07-18 14:45:15
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beautybanana

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+5, EPI+1): Good！不改专家本色哦！ 2011-07-19 16:31:05
引用回帖:
Originally posted by maomao809920 at 2011-07-17 16:05:42:
最近在做PCR，新手一枚，跨专业到生物化学专业。。
师哥指导下做了PCR，之后跑了电泳，但是什么都没有。
然后师哥自己做了一遍（同样的药品、仪器、体系），电泳后就有条带了。。
之后自己又做了一遍，依旧没有 ...

同样的条件，熟练的人可以做出来，生手不一定能做的出来，对于新手来说，一般都是加样的问题，很难将少至于0.几ul 的样品加准确，这个最好用移液枪吸水打到PCR管中来联系，在熟练人员的指导下，看0.2ul在枪头什么位置，0.5ul在枪头什么位置，2ul在枪头什么位置（一般来说，同样型号的枪头规格差别不大）相同体积的液体所在枪头的位置大致相同，这样吸取多少样做到心中有数，拿移液枪时，右手拿枪，左手的食指或中指（一个指头就可以）轻轻压着移液枪的中部位置（大概位置）这样加样的时候在2个手的作用下会更平衡些，加到PCR管中的时候轻轻的靠近管壁打下去，使打下去的液体成为一个点，每次加样的时候，在靠近上次加样（那个液体点）附近再打下去也是一个点，点与点之间保持一定的距离，这样你加几个样就会有几个点，不会使你混乱的，最后加水的时候可以把各个点稍微冲下去就好了，点动离心一下液体都会下去混匀了。新手要多练加样技术，可以拿空白的水作为PCR的各种成分加样，多多练习必然会熟练的。
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10楼2011-07-18 20:55:03
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