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maomao809920金虫 (小有名气)
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[求助]
RCR自己怎么都做不出来，但是同样条件下师哥帮着做了，却出来了，求助原因
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最近在做PCR，新手一枚，跨专业到生物化学专业。。 师哥指导下做了PCR，之后跑了电泳，但是什么都没有。 然后师哥自己做了一遍（同样的药品、仪器、体系），电泳后就有条带了。。 之后自己又做了一遍，依旧没有，很桑心。想知道为什么。。 分析了一下，觉得应该是自己使用移液枪加样的不规范导致的，在加样的时候应该注意什么，是不是每次加样的时候，枪头都要深入至小离心管管底？ 求各位大侠指导了，是不是我操作有问题。。 先谢谢了！ |
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 【分子生物】EPI帖 |
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2楼2011-07-17 19:00:41
dhd997
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3楼2011-07-17 20:06:51
maomao809920
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4楼2011-07-17 21:53:39
maomao809920
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5楼2011-07-17 21:58:12
zcqcau
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6楼2011-07-18 00:36:48
天使托
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T.Shen
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【答案】应助回帖
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dhd997(金币+5): good 2011-07-18 12:46:32
dhd997(EPI+1): 没仔细看 2011-07-18 12:47:24
dhd997(金币+5): good 2011-07-18 12:46:32
dhd997(EPI+1): 没仔细看 2011-07-18 12:47:24
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新手呀，没有做出来很正常的；慢慢来就可以很随意的； PCR这个东西呢，首先你得先搞清楚原理是什么，就是体系中各个样品是干什么的，这个必须清楚，不要等做过很多PCR了，才发现里面什么东西是干什么的都不知道，就悲催了； 首先呢，体系呢，小到10ul，大到100--200都有的，不同目的，不一样的体系； 体系中有什么呢？去离子水 模板 引物（sense antisense） 酶 Buffer dNTP 一般就这六种，有时候还会添加甘油，DMSO KCL； 还有就是操作的时候，一定要细心认真，因为加的量都比较小，所以要用准确一点的移液枪，稍有不慎就会多加或者少加，所以这一步很重要滴； 下来就是程序的设计了，主要需要注意的是退火温度和延伸时间的选择了，不同目的不一样的，慢慢做就会很随意的。 加油！祝福ing  |
7楼2011-07-18 12:45:06
8楼2011-07-18 14:13:15
9楼2011-07-18 14:45:15
beautybanana
木虫 (著名写手)
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【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+5, EPI+1): Good！不改专家本色哦！ 2011-07-19 16:31:05
西瓜(金币+5, EPI+1): Good！不改专家本色哦！ 2011-07-19 16:31:05
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同样的条件，熟练的人可以做出来，生手不一定能做的出来，对于新手来说，一般都是加样的问题，很难将少至于0.几ul 的样品加准确，这个最好用移液枪吸水打到PCR管中来联系，在熟练人员的指导下，看0.2ul在枪头什么位置，0.5ul在枪头什么位置，2ul在枪头什么位置（一般来说，同样型号的枪头规格差别不大）相同体积的液体所在枪头的位置大致相同，这样吸取多少样做到心中有数，拿移液枪时，右手拿枪，左手的食指或中指（一个指头就可以）轻轻压着移液枪的中部位置（大概位置）这样加样的时候在2个手的作用下会更平衡些，加到PCR管中的时候轻轻的靠近管壁打下去，使打下去的液体成为一个点，每次加样的时候，在靠近上次加样（那个液体点）附近再打下去也是一个点，点与点之间保持一定的距离，这样你加几个样就会有几个点，不会使你混乱的，最后加水的时候可以把各个点稍微冲下去就好了，点动离心一下液体都会下去混匀了。新手要多练加样技术，可以拿空白的水作为PCR的各种成分加样，多多练习必然会熟练的。 |
10楼2011-07-18 20:55:03
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