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maomao809920金虫 (小有名气)
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[求助]
RCR自己怎么都做不出来，但是同样条件下师哥帮着做了，却出来了，求助原因
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最近在做PCR，新手一枚，跨专业到生物化学专业。。 师哥指导下做了PCR，之后跑了电泳，但是什么都没有。 然后师哥自己做了一遍（同样的药品、仪器、体系），电泳后就有条带了。。 之后自己又做了一遍，依旧没有，很桑心。想知道为什么。。 分析了一下，觉得应该是自己使用移液枪加样的不规范导致的，在加样的时候应该注意什么，是不是每次加样的时候，枪头都要深入至小离心管管底？ 求各位大侠指导了，是不是我操作有问题。。 先谢谢了！ |
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 【分子生物】EPI帖 |
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【答案】应助回帖
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dhd997(金币+5): good 2011-07-18 12:46:32
dhd997(EPI+1): 没仔细看 2011-07-18 12:47:24
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dhd997(EPI+1): 没仔细看 2011-07-18 12:47:24
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新手呀，没有做出来很正常的；慢慢来就可以很随意的； PCR这个东西呢，首先你得先搞清楚原理是什么，就是体系中各个样品是干什么的，这个必须清楚，不要等做过很多PCR了，才发现里面什么东西是干什么的都不知道，就悲催了； 首先呢，体系呢，小到10ul，大到100--200都有的，不同目的，不一样的体系； 体系中有什么呢？去离子水 模板 引物（sense antisense） 酶 Buffer dNTP 一般就这六种，有时候还会添加甘油，DMSO KCL； 还有就是操作的时候，一定要细心认真，因为加的量都比较小，所以要用准确一点的移液枪，稍有不慎就会多加或者少加，所以这一步很重要滴； 下来就是程序的设计了，主要需要注意的是退火温度和延伸时间的选择了，不同目的不一样的，慢慢做就会很随意的。 加油！祝福ing  |
7楼2011-07-18 12:45:06