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echochen1017新虫 (初入文坛)
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PCR重复不出来
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| 之前在3月份PCR除了结果，并测序，现在重复，已经重复5天，没有任何条带，调高、调低模板浓度，并且在冰上加样，也没有目的条带，低浓度样品在500bp左右出现非特异性条带，请教这是什么情况呢？ |
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8楼2014-10-27 19:54:48
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【答案】应助回帖
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kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-06-09 22:04:32
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kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-06-09 22:04:32
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你的PCR出现非特异性扩增带和可重复性低本质就是你的PCR的专一性不够。 PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带 与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、 或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶 则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。 其对策有：首先可以调整镁离子的浓度， 由5.0mmol/L起以0.05mmol/L为单位逐渐下降至1.0mmol/L，降低镁离子的浓度无效的话，也可以提高镁离子浓度，最高不超过10.0mmol/L.调整引物浓度（你的非特异性扩增多，因此应适当降低引物浓度），适当增加模板量，减少循环次数。减低酶量或调换另一来源的酶。适当提高退火温度。 使用热启动的PCR.可用石蜡隔离方式：先放引物、模板、缓冲溶液（以上称为A液）入PCR管，然后加入固体石蜡，75度水浴PCR管5分钟，目视石蜡完全融化后拿PCR管出水浴锅室温下竖直放置约15分钟，待石蜡重新凝固为固体层后，在石蜡层上加入聚合酶、dNTP、MgCl2、缓冲溶液（以上称为B液），也就是使固体石蜡层隔离A液与B液在PCR管的上下两层。反应开始后，石蜡再度熔化，反应体系形成。每种调整均可以分梯度进行。 一般商用的酶制剂里都还有甘油，酶的用量较大时最好是事先超滤或者透析去除一些甘油。 加入0.01%的BSA，白明胶或者Tritom X-100.也有助于提高PCR反应的专一性和可重复性。以上都不行则要重新设计引物。 另外，时机最好用新鲜的，操作注意防止污染。 |
2楼2013-06-08 17:25:06
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