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PCR好多次了，一直没结果，麻烦各位帮我看看是哪出问题了？ 已有1人参与
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这是我PCR后的琼脂糖电泳图，2%的 胶，跑了15分钟，120V。DNA模板是提取出来后在4度放了10多天的，引物是新和成的。25UL的体系，DNA 加了3UL.麻烦各位给我分析一下是哪出问题了？？？？？？毕业论文，很急啊，，大侠们帮帮忙吧！！！ |
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 【分子生物】EPI帖 |
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chiden
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【答案】应助回帖
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小丹木木: 金币+5, 恩，分析的很全面哦 2012-05-29 13:50:42
西瓜: MolEPI+1, Good！ 2012-05-31 09:34:34
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西瓜: MolEPI+1, Good！ 2012-05-31 09:34:34
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看上面的电泳图的话，应该不是特异引物吧，二聚体的带都不明显。 一般来说如果是模板的问题，那么重复了多次的PCR产物中，二聚体的带应该是有比较好的，比较亮的不会跑的这么难看。 PCR扩增不出来，问题可能是多方面的。 1、确认模板DNA是否真的有DNA。这个检测的方法有很多，简单的就是用直接用模板DNA跑电泳，取个3UL，有带存在表明DNA确实有，当然这个条带的亮度就和DAN浓度的高低有关了。有可能是一条很淡的条带，要仔细看。DNA在4度可以保存两个多月没问题的，放心。 2、检查体系比例是否有问题。 3、检查PCR扩增条件设置是否正确，就像上面前辈说的，设个梯度。 4、检查引物是否仍然存在，如有要及时更换。 |
4楼2012-05-27 23:35:59
jingdejun
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【答案】应助回帖
★ ★ ★
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小丹木木: 金币+3, 鼓励应助，欢迎交流 2012-05-28 15:57:23
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引物不用检查有没有问题，直接换一管新的就可以了（不要说你没分装啊  ）。因为一般合成一次引物的量，做个几百次是没问题的，要是怀疑引物出了问题，就直接换新的，引物绝对够的。至于胶的浓度，它与所跑的DNA的大小是有关系的，DNA越小胶浓度就要越大，至于具体用什么浓度的胶就要具体看你的片段大小了。但是假如你要检测引物的话，我觉得不大合适，因为引物实在是太短了，胶浓度过大了又不好操作。 2%的胶Goldview没溶好，绝对是操作问题，下次配胶的时候注意一下就ok了，实在不行的话，请教实验室的有经验的人啊。多交流嘛。 然后是你的引物稀释有问题。引物稀释与引物的OD或nmol数有关，不是说不管什么引物都直接稀释100倍就可以的。再说了，引物合成的单子背面不是有写该怎么稀释吗？ 同学，做实验要细心哦。 最后，祝实验顺利。 |
7楼2012-05-28 09:19:59
孙启亮
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yinchu1990 
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trizol11
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