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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR好多次了，一直没结果，麻烦各位帮我看看是哪出问题了？
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一杯清茶puma

铁虫 (初入文坛)

[求助] PCR好多次了，一直没结果，麻烦各位帮我看看是哪出问题了？ 已有1人参与

这是我PCR后的琼脂糖电泳图，2%的 胶，跑了15分钟，120V。DNA模板是提取出来后在4度放了10多天的，引物是新和成的。25UL的体系，DNA 加了3UL.麻烦各位给我分析一下是哪出问题了？？？？？？毕业论文，很急啊，，大侠们帮帮忙吧！！！
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1楼 2012-05-27 22:16:26
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回帖置顶 ( 共有1个 )

chiden

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+5, 恩，分析的很全面哦 2012-05-29 13:50:42
西瓜: MolEPI+1, Good！ 2012-05-31 09:34:34
看上面的电泳图的话，应该不是特异引物吧，二聚体的带都不明显。
一般来说如果是模板的问题，那么重复了多次的PCR产物中，二聚体的带应该是有比较好的，比较亮的不会跑的这么难看。
PCR扩增不出来，问题可能是多方面的。
1、确认模板DNA是否真的有DNA。这个检测的方法有很多，简单的就是用直接用模板DNA跑电泳，取个3UL，有带存在表明DNA确实有，当然这个条带的亮度就和DAN浓度的高低有关了。有可能是一条很淡的条带，要仔细看。DNA在4度可以保存两个多月没问题的，放心。
2、检查体系比例是否有问题。
3、检查PCR扩增条件设置是否正确，就像上面前辈说的，设个梯度。
4、检查引物是否仍然存在，如有要及时更换。
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即使难过，也要微笑着走下去
4楼2012-05-27 23:35:59
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

jingdejun

铁杆木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助，欢迎交流 2012-05-28 15:57:23
引用回帖:
5楼: Originally posted by 一杯清茶puma at 2012-05-28 08:30:23
还想请问一下如果要检查引物是否有问题应该用多少的胶跑啊？？？
还有就是PCR产物检测用1%的胶行吗？因为2%的胶每次Goldview都不好溶。
我们把引物直接加水稀释了100倍，应该没问题吧？？？...

引物不用检查有没有问题，直接换一管新的就可以了（不要说你没分装啊）。因为一般合成一次引物的量，做个几百次是没问题的，要是怀疑引物出了问题，就直接换新的，引物绝对够的。

至于胶的浓度，它与所跑的DNA的大小是有关系的，DNA越小胶浓度就要越大，至于具体用什么浓度的胶就要具体看你的片段大小了。但是假如你要检测引物的话，我觉得不大合适，因为引物实在是太短了，胶浓度过大了又不好操作。

2%的胶Goldview没溶好，绝对是操作问题，下次配胶的时候注意一下就ok了，实在不行的话，请教实验室的有经验的人啊。多交流嘛。

然后是你的引物稀释有问题。引物稀释与引物的OD或nmol数有关，不是说不管什么引物都直接稀释100倍就可以的。再说了，引物合成的单子背面不是有写该怎么稀释吗？  同学，做实验要细心哦。

最后，祝实验顺利。
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7楼2012-05-28 09:19:59
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普通回帖

孙启亮

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
楼主确定你的引物可用吗？看图的话感觉条带弥散，有二聚体。理论上讲DNA模板放10天是没有问题的呀
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2楼2012-05-27 22:55:20
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maoyong

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-28 15:56:44
楼主你要注意两方面的问题：
(1)检测DNA模板的浓度和纯度，是否发生降解；
(2)引物是哪种，如果是特异引物的话就需要重新设计了，没有特异带，另外可以做个梯度试试。
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3楼2012-05-27 23:21:50
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一杯清茶puma

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by chiden at 2012-05-27 23:35:59
看上面的电泳图的话，应该不是特异引物吧，二聚体的带都不明显。
一般来说如果是模板的问题，那么重复了多次的PCR产物中，二聚体的带应该是有比较好的，比较亮的不会跑的这么难看。
PCR扩增不出来，问题可能是多方 ...

还想请问一下如果要检查引物是否有问题应该用多少的胶跑啊？？？
还有就是PCR产物检测用1%的胶行吗？因为2%的胶每次Goldview都不好溶。
我们把引物直接加水稀释了100倍，应该没问题吧？？？
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5楼2012-05-28 08:30:23
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yinchu1990

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+2, 欢迎新虫多多交流 2012-05-31 09:34:48
可以用百分之1的胶 引物浓度是多少呢
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6楼2012-05-28 08:58:52
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256k

新虫 (正式写手)
★
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-05-29 13:50:58
可能原因：模版问题，引物问题，酶问题。模版确定降解的不是太厉害；引物设计后验证特异些；分析你的目的序列，是否有高GC、二级结构等，换其他合适的扩增酶.
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8楼2012-05-28 11:18:38
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trizol11

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-28 15:57:34
战友，请看：
1，你的模版浓度太低，
2，引物不当，
3，延伸时间短。退货温度高，
也有可能是你的buffer对样品不适合。
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任重道远……
9楼2012-05-28 12:38:09
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一杯清茶puma

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by jingdejun at 2012-05-28 09:19:59
引物不用检查有没有问题，直接换一管新的就可以了（不要说你没分装啊）。因为一般合成一次引物的量，做个几百次是没问题的，要是怀疑引物出了问题，就直接换新的，引物绝对够的。

至于胶的浓度，它与所跑的DN ...

引物是按单子上说的稀释的。。。下次制胶的时候我一定小心点。谢谢啦。。
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10楼2012-05-28 12:40:30
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