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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】急!有关PCR中出现的一些问题,大家帮我看看啊!
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wwsw38

铁虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】急!有关PCR中出现的一些问题,大家帮我看看啊! 已有5人参与

我在做的是16SRDNA的PCR,细菌鉴定.以下问题不明白,望大家帮我下:
            1.我提取的DNA中有大量的RNA,这对PCR有什么影响吗?如果加RNAse消除RNA,这对PCR会不会有影响?
            2.我P出来的结果含有非特异性杂带,是不是要提高退火温度?
            3.送去公司测序一般要多少微升才够?
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为自己加油
1楼 2010-04-25 22:13:04
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434744419

金虫 (小有名气)
建议还是换引物吧 如果引物好的话，退火温度查五度都能P出来
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2楼2010-04-25 23:10:57
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1110rainjob

铜虫 (小有名气)
个人认为有RNA应该不影响你的结果；
存在非特异性条带，你可以提高退火温度，降低模板量试试；
一般测序均是将PCR产物连接到T载，转化到大肠杆菌中，经鉴定后送菌液去测序。
现在也可以直接送PCR产物，但是PCR片段需较小，且除了体积外，对浓度也是有要求的。具体的量你咨询你将送去测序的生物公司代理商即可。
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3楼2010-04-26 00:50:20
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308145157

木虫 (著名写手)
最好还是用RNase处理下，少量的RNase对PCR没什么影响，另外，建议不要用PCR产物直接测序，虽然方便但是问题真的很多，最好还是和T载体等连接好了，直接送重组子过去侧序。退火温度自己还是做个梯度比较合适，多试几个温度也不麻烦，不想试的话就做个胶回收吧。
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心若在，梦就在......
4楼2010-04-26 08:55:25
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fungixx

至尊木虫 (文坛精英)

优秀版主优秀版主优秀版主
提基因组的时，可以在抽提前加点RNase处理一段时间；
可以适当提高引物退火温度，如果不行的话可能就是引物设计问题了；
如果拿pcr片段测序的话量很少，好像才是多少pmol ，不过不能有杂带啊
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几年前踏上火车那一刻都还没有意识到,从此故乡只有冬夏,再无春秋
5楼2010-04-26 09:01:08
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shengwufenzi

金虫 (正式写手)
wwsw38(金币+1): 2010-04-26 14:25
1、你该加入加RNAse消除RNA,RNAse一般对PCR不会有影响，当然，你也可以用广谱蛋白酶再将RNAse除去。
2、产生非特异性杂带，解决要①减少Taq酶的量，或调换另一来源的酶。②减少dNTP的浓度。③适当降低Mg2+浓度。④增加模板量，减少引物的用量，减少循环次数，提高退火温度。
3、.送去公司测序一般是先将你得到的片段进行转化，筛选后挑取菌斑交给生物公司。
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6楼2010-04-26 09:06:55
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