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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 同一个平板上挑的两个菌测序，序列差很多，大家帮我看看啊，有比对图！谢谢啦
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陈年芬芳

新虫 (小有名气)

[求助] 同一个平板上挑的两个菌测序，序列差很多，大家帮我看看啊，有比对图！谢谢啦

4-3-1和4-3-2是一个菌斑摇菌后分装的两管样品测序结果
4-2-1和4-2-2是同一个平板上另一个菌斑摇菌后分装的两管测序结果
91和92是引物。
四个样品的峰图都没有问题
为什么4-3这组和4-2这组的序列差这么多啊？都是同一批的啊。
第一次碰到这种情况，以前也只是二三个碱基的差异，这次差太多了，什么原因啊？
我们这个没有人做，也没法和别人比对。肿么办？
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1楼 2012-04-08 13:57:40
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回帖置顶 ( 共有1个 )

cheng_xiao

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
西瓜: 金币+5, MolEPI+1, 鼓励热心交流~几个帖子一起授予EPI一枚~ 2012-05-31 09:29:31
陈年芬芳: 金币+2, ★★★很有帮助 2012-05-31 10:36:41
好吧，其实很简单啊，假基因说白了就是长得和正常基因没什么不同，但不行使功能，不行使功能的原因有多种，其中一种可能就是正常基因突变造成的，正常基因突变后，其本身功能发生大的变化，生物体本身会检测到，然后就命令此基因不表达了，此基因就变成了假基因储存在基因组内，以备后用（现在条件下基因产物不能用不代表以后生物体不用），现在生物体内尤其是高等生物体内，假基因的数量数量
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我努力我奋斗我成功
12楼2012-04-12 15:59:03
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超然渡陈

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+3, Good！ 2012-04-10 18:31:14
有可能是PCR过程特异性不是很好，有非特异条带，但是在电泳时没有分开，挖胶回收时一起挖了，后来被一起连接到载体上。还有可能是片段和载体酶切时间过长，内切酶产生了星活性，把片段和载体切碎了，这样连接转化之后测序会出现很多五花八门的结果。楼主不用纠结，只要有一个是真阳性就行了。一个阳性也没有建议重新做，不用去找具体原因，因为找原因远远比重做要费时间，很多时候导致失败的原因不止一个。
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6楼2012-04-09 15:11:48
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asdf6074053

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
这么低的相似性一定是有???阳性的，为什么??是跟目的??列比对呢？而是他们相互比？而且我感觉如果挑克隆时没问题的??是没必??将???克隆分两管?????独测??的，你的是???在平???上长了多久开始挑的？
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2楼2012-04-09 12:42:50
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asdf6074053

新虫 (初入文坛)
★ ★
西瓜: 金币+2, 鼓励交流 2012-04-10 18:30:43
不好意思，不知怎么的就乱码了，其实单克隆是没必要分量管单独测序的，除非挑克隆过程就有问题。你是在菌长了多久挑的克隆？
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3楼2012-04-09 12:53:01
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hyacinth326

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+2, 鼓励交流~很活跃啊！ 2012-04-10 18:30:58
差这么多，应该不是一个基因在PCR过程中突变的吧，分析原因可能是模板就不单一吧，然后PCR出来的产物就不单一，连接之后肯定每个克隆都不一样了。。。
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5楼2012-04-09 15:00:40
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asdf6074053

新虫 (初入文坛)
★ ★
西瓜: 金币+2, 鼓励交流 2012-04-10 18:31:43
建议还是重新做酶切（尽量规范），连接，转化，然后涂抗性板子。挑克隆是可以多挑一些(我以前都是10个左右)，放EP管里加上有抗性的培养基摇，然后摇出来的做菌液PCR就行，P出来的送测序，也用不了多久的
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7楼2012-04-10 18:19:45
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yingyangyang

木虫 (正式写手)
★ ★
西瓜: 金币+2, Good！ 2012-05-31 09:29:45
要么是你导入的片段有污染或者带有其他不是你想要的片段也导入成功了，成了阳性克隆，你挑出来了。
一般克隆都不会选两个来送测序，我做都是前面克隆多挑十来个，做酶切验证，然后选取一个送测序。  不知道你用的是什么载体，是否对于你挑选阳性克隆有影响。
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15楼2012-05-30 20:47:43
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yingyangyang

木虫 (正式写手)
引用回帖:
17楼: Originally posted by 陈年芬芳 at 2012-05-31 10:41:18
我觉得这个可能性最大了，但是如果这样的话，仍然阳性的的就直接测序了，没有做酶切啊。...

我们一般会做个没切验证下片段导入的大小和正确位置，因为我们想要导入的片段大小一般是固定的，所有根据酶切片段的大小可以判断插入片段的大小，同是可以进一步确认片段插入位点的正确性。因为插入位点若不正确，酶切后片段大小很正确插入位点的酶切结果是不一样的。
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18楼2012-06-02 23:12:17
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普通回帖

陈年芬芳

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by asdf6074053 at 2012-04-09 12:53:01:
不好意思，不知怎么的就乱码了，其实单克隆是没必要分量管单独测序的，除非挑克隆过程就有问题。你是在菌长了多久挑的克隆？

大概14个小时吧，测两个也是为了有保障，但是为什么两个菌斑的结果差异这么大啊？
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4楼2012-04-09 13:05:33
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bonbonzd

木虫 (小有名气)
是不是两个序列，是一正一反，没有反转就直接比对了？
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8楼2012-04-10 22:40:58
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cheng_xiao

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-31 09:27:57
我觉的就是连接上的东西本身不一样，这你不用纠结，正常，再说了，你比对的结果相似性还是很高的，相似性大于70%就可以判定是同一类基因，也许你扩增时把假基因（假基因无处不在，菌类较少）一同扩增出来了，恰好测序了，这你就发了，你可以借此为突破，找出基因的功能区域，呵呵，实验顺利啊
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我努力我奋斗我成功
9楼2012-04-11 09:13:31
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陈年芬芳

新虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by bonbonzd at 2012-04-10 22:40:58:
是不是两个序列，是一正一反，没有反转就直接比对了？

不会的，我是按照一个方向来的，反转后就差的更多了
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10楼2012-04-12 12:22:24
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