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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 【求助】有人在做焦磷酸测序么？希望得到大虾的帮助
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JessieDai

铜虫 (小有名气)

[交流] 【求助】有人在做焦磷酸测序么？希望得到大虾的帮助已有10人参与

实验室想做高通量测序，貌似一般就是那个焦磷酸测序吧，由于没找到太多的关于这方面的知识，基本处于什么都不清楚的状态，希望做这个的大虾能够介绍一下或者给点相关的资料，O(∩_∩)O谢谢
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二代测序 高通量测序

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1楼2011-04-05 21:16:59
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

genomelin

银虫 (小有名气)
★ ★
看天(金币+2, EPI+1): 热情大方 授予一个EPI 希望常来 2011-04-06 18:18:12
有什么想问的？可以问我，在这个版上很少看到2代测序的应用以及bioinformatic交流的帖子，但希望你能现简单熟悉一下2代测序仪，毕竟已经问世很多年了，这些资料在相应公司网站上很容易查到。如果在应用过程中有什么困难或者对于实验设计方面有哪些要注意的可以问我，我从08年开始就应用第二代测序仪做转录组的研究了，2010开始拓展到大型基因组方向，对于实验和分析的实际操作的一些问题和困难还是很清楚地。或者你可以看一下综述性的文章。目前的研究在国内太火了，都想做2代测序的应用，但很多对于实验设计和分析都是估计不足的。所以希望在这些方面能够对大家有些帮助

[ Last edited by genomelin on 2011-4-6 at 15:15 ]
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5楼2011-04-06 15:01:26
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rb

木虫 (著名写手)

小笨虫虫
★
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看天(EPI+1): 鼓励分享自己的实验经历 2011-04-06 18:19:33
06年自己做这方面工作时候的一个情况。后来很少接触。（直接copy过来了不再编辑了，少了一些图片）

I 原理简介：
        测序引物与单链PCR扩增的DNA模板相结合。然后将其与DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶，以及底物APS和荧光素一起孵育。
        四种dNTP（dATP，dTTP，dCTP，dGTP）之一被加入反应体系，如与模扳配对（A—T，C—G），此dNTP与引物的末端形成共价键，dNTP的焦磷酸基团（PPi）释放出来。而且释放出来的Ppi的量与和模板结合的dNTP的量成正比。
         ATP硫酸化酶在腺苷酰硫酸存在的情况下催化PPi形成ATP，ATP驱动荧光素酶介导的萤光素向氧合萤光素的转化，氧合萤光素发出与ATP量成正比的可见光信号。光信号由CCD摄像机检测并由pyrogram™反应为峰。每个光信号的峰高与反应中掺入的核苷酸数目成正比。
        ATP和未掺入的dNTP由三磷酸腺苷双磷酸酶降解，淬灭光信号，并再生反应体系。
        然后加入下一种dNTP。最终待测序列顺序，即可从反应光强的信号峰中读出。在此过程之中有几点值得注意的是，在体系中使用的是dATP S而非dATP，因为dATP S不是荧光素酶的底物，而且DNA聚合酶对dATP S的催化效率更高。而且在系统之中，底物的浓度已经最佳化，使得dNTP的降解速度慢于它的掺入速度，ATP的合成速度快于水解速度，其中三磷酸腺苷双磷酸酶的特异浓度，可以保证降解完全，使系统复原。

II 操作步骤：
        在使用前，保证所有溶液都达到室温；
        在PSQ 96板中预先加入45μl含有0.3μM测序引物的annealing buffer；
        使用Vertex混匀Sepharose beads；
        将需要使用的sepharoe beads总量（每样本3μl）转移到一个Eppendorf管中；
        在sepharose bead中加入binding buffer，使得平均每个样品约有50μl的体积，将混合物混匀；
        将以上混合物加入PCR产物（50μl反应体积）中，每样本50μl；
        将PCR产物在常温下混匀10分钟，使得beads与生物素结合，对于较长片段，可适当延长混匀时间；
        在Vacuum prep workstation中，四个样品板中依次加入180ml高纯水、70％乙醇、washing buffer和120ml Denaturation buffer；
        打开vacuum prep workstation的泵，将vacuum prep tool在高纯水中清洗30秒；
        然后将vacuum prep tool移到PCR板中，抓取sepharose beads（请在beads与PCR产物结合后三分钟内完成此操作）；
        拿起PCR板，检查是否大部分beads都被吸附在了vacuum prep tool上；
        将vacuum prep tool放入70％乙醇中5秒；
        然后移到denatureation buffer中5秒；
        再移到washing buffer中清洗5－10秒；
        关掉泵；
        将vacuum prep tool放入含有测序引物的板中，摇动，释放sepharose beads（测序引物也可最后加入）
        使用高纯水清洗vacuum prep tool；
        将放有样品的PSQ 96板放在ThermoPlate上加热到80℃ 2分钟，再冷却到室温，即可进行Pyrosequencing反应。
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寝室楼的大爷、大妈都是哲学家，他们每天都在思考人类最根本的三个问题：你是谁？你从哪儿来？要去哪儿？
6楼2011-04-06 15:39:36
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yingyangyang

木虫 (正式写手)
★
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想做高通量测序，上海伯豪生物公司挺不错的！很多人在这里做，有SOLiD5500和illumina公司的hiseq2000等等，你只要提供你的样品，公司就可以帮你构建好文库，上机测序，并且最后的数据也会筛选好给你们，你们要是想学习可以跟公司说就可以跟着一起顺便学习下分析！
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9楼2012-06-08 16:13:15
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普通回帖

janyan

银虫 (初入文坛)
★ ★ ★
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看天(金币+2): 鼓励交流 2011-04-06 12:57:50
那天QIAGEN公司的来讲了一次焦磷酸测序，有不少解决方案，而且貌似给他们做也省钱，你可以试试，我还没做过焦磷酸，只能提供这点信息咯，希望有用呵呵
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2楼2011-04-05 23:34:35
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JessieDai

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by janyan at 2011-04-05 23:34:35:
那天QIAGEN公司的来讲了一次焦磷酸测序，有不少解决方案，而且貌似给他们做也省钱，你可以试试，我还没做过焦磷酸，只能提供这点信息咯，希望有用呵呵

谢谢了哦，我也是听一个老师讲了一次而已，是要送给公司做，但是前面的PCR还是要自己做的，所以还要自己设计个试验方法。
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3楼2011-04-06 08:42:39
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holyala

木虫 (著名写手)

砖家
★ ★ ★
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看天(金币+2): 鼓励回答 2011-04-06 12:58:03
嗯...对于不熟悉高通量测序，但又想做一些这方面实验的童鞋们，我的建议是先好好了解一下这项技术，想清楚实验目的是什么，测序要获得哪些主要信息。因为这个玩意儿少说也要几万块（小RNA之类不算），要测的样本多，几十万上百万的花费也是有可能的。所以先自己想明白了，才好和测序公司谈。
最后，更正一点，高通量测序可不止焦磷酸测序一种，具体的可以看看下面的资料~

http://g.zhubajie.com/urllink.php?id=109434909uls2xeuwys00rq4
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4楼2011-04-06 09:29:53
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gaoyang636

木虫 (著名写手)
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看天(金币+4): 有理 2011-04-06 18:19:57
1 高通量不仅仅是焦磷酸测序；
2 罗氏的454是焦磷酸，但是通量比其他的二代低，每个RUN需要的银子也多，好处是读长很长（400bp+）；
3 Qiagen的焦磷酸测序还不是一般意义上的高通量二代测序，虽然测序原理是一样的，但是通量更小，且一般是需要自己选择目的基因并设计引物的；
4 LZ即便打算要做高通量了，也没必要自己去设计protocol，需要做的是选择适合自己的方案，然后会有现成的protocol，比你自己摸索的强……
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7楼2011-04-06 18:12:34
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ct86117

新虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
弱弱的问：去哪找现成的protocol啊，菜鸟中~
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8楼2011-06-16 13:58:49
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foreverwu2

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
357335楼: Originally posted by genomelin at 2011-04-06 15:01:26
有什么想问的？可以问我，在这个版上很少看到2代测序的应用以及bioinformatic交流的帖子，但希望你能现简单熟悉一下2代测序仪，毕竟已经问世很多年了，这些资料在相应公司网站上很容易查到。如果在应用过程中有什么 ...

请问一下用454高通量测土壤微生物多样性能不能鉴定出土壤中某些具体的微生物（比如和氮循环有关的微生物）的种类名称
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10楼2013-03-31 11:00:42
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