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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 【求助】有人在做焦磷酸测序么？希望得到大虾的帮助
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genomelin

银虫 (小有名气)
★ ★
看天(金币+2, EPI+1): 热情大方 授予一个EPI 希望常来 2011-04-06 18:18:12
有什么想问的？可以问我，在这个版上很少看到2代测序的应用以及bioinformatic交流的帖子，但希望你能现简单熟悉一下2代测序仪，毕竟已经问世很多年了，这些资料在相应公司网站上很容易查到。如果在应用过程中有什么困难或者对于实验设计方面有哪些要注意的可以问我，我从08年开始就应用第二代测序仪做转录组的研究了，2010开始拓展到大型基因组方向，对于实验和分析的实际操作的一些问题和困难还是很清楚地。或者你可以看一下综述性的文章。目前的研究在国内太火了，都想做2代测序的应用，但很多对于实验设计和分析都是估计不足的。所以希望在这些方面能够对大家有些帮助

[ Last edited by genomelin on 2011-4-6 at 15:15 ]
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5楼2011-04-06 15:01:26
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小笨虫虫
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
看天(EPI+1): 鼓励分享自己的实验经历 2011-04-06 18:19:33
06年自己做这方面工作时候的一个情况。后来很少接触。（直接copy过来了不再编辑了，少了一些图片）

I 原理简介：
        测序引物与单链PCR扩增的DNA模板相结合。然后将其与DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶，以及底物APS和荧光素一起孵育。
        四种dNTP（dATP，dTTP，dCTP，dGTP）之一被加入反应体系，如与模扳配对（A—T，C—G），此dNTP与引物的末端形成共价键，dNTP的焦磷酸基团（PPi）释放出来。而且释放出来的Ppi的量与和模板结合的dNTP的量成正比。
         ATP硫酸化酶在腺苷酰硫酸存在的情况下催化PPi形成ATP，ATP驱动荧光素酶介导的萤光素向氧合萤光素的转化，氧合萤光素发出与ATP量成正比的可见光信号。光信号由CCD摄像机检测并由pyrogram™反应为峰。每个光信号的峰高与反应中掺入的核苷酸数目成正比。
        ATP和未掺入的dNTP由三磷酸腺苷双磷酸酶降解，淬灭光信号，并再生反应体系。
        然后加入下一种dNTP。最终待测序列顺序，即可从反应光强的信号峰中读出。在此过程之中有几点值得注意的是，在体系中使用的是dATP S而非dATP，因为dATP S不是荧光素酶的底物，而且DNA聚合酶对dATP S的催化效率更高。而且在系统之中，底物的浓度已经最佳化，使得dNTP的降解速度慢于它的掺入速度，ATP的合成速度快于水解速度，其中三磷酸腺苷双磷酸酶的特异浓度，可以保证降解完全，使系统复原。

II 操作步骤：
        在使用前，保证所有溶液都达到室温；
        在PSQ 96板中预先加入45μl含有0.3μM测序引物的annealing buffer；
        使用Vertex混匀Sepharose beads；
        将需要使用的sepharoe beads总量（每样本3μl）转移到一个Eppendorf管中；
        在sepharose bead中加入binding buffer，使得平均每个样品约有50μl的体积，将混合物混匀；
        将以上混合物加入PCR产物（50μl反应体积）中，每样本50μl；
        将PCR产物在常温下混匀10分钟，使得beads与生物素结合，对于较长片段，可适当延长混匀时间；
        在Vacuum prep workstation中，四个样品板中依次加入180ml高纯水、70％乙醇、washing buffer和120ml Denaturation buffer；
        打开vacuum prep workstation的泵，将vacuum prep tool在高纯水中清洗30秒；
        然后将vacuum prep tool移到PCR板中，抓取sepharose beads（请在beads与PCR产物结合后三分钟内完成此操作）；
        拿起PCR板，检查是否大部分beads都被吸附在了vacuum prep tool上；
        将vacuum prep tool放入70％乙醇中5秒；
        然后移到denatureation buffer中5秒；
        再移到washing buffer中清洗5－10秒；
        关掉泵；
        将vacuum prep tool放入含有测序引物的板中，摇动，释放sepharose beads（测序引物也可最后加入）
        使用高纯水清洗vacuum prep tool；
        将放有样品的PSQ 96板放在ThermoPlate上加热到80℃ 2分钟，再冷却到室温，即可进行Pyrosequencing反应。
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寝室楼的大爷、大妈都是哲学家，他们每天都在思考人类最根本的三个问题：你是谁？你从哪儿来？要去哪儿？
6楼2011-04-06 15:39:36
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