应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 【求助】有人在做焦磷酸测序么？希望得到大虾的帮助
21/1返回列表
查看: 4178  |  回复: 13
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
本帖产生 2 个 BioEPI ，点击这里进行查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

genomelin

银虫 (小有名气)
★ ★
看天(金币+2, EPI+1): 热情大方 授予一个EPI 希望常来 2011-04-06 18:18:12
有什么想问的？可以问我，在这个版上很少看到2代测序的应用以及bioinformatic交流的帖子，但希望你能现简单熟悉一下2代测序仪，毕竟已经问世很多年了，这些资料在相应公司网站上很容易查到。如果在应用过程中有什么困难或者对于实验设计方面有哪些要注意的可以问我，我从08年开始就应用第二代测序仪做转录组的研究了，2010开始拓展到大型基因组方向，对于实验和分析的实际操作的一些问题和困难还是很清楚地。或者你可以看一下综述性的文章。目前的研究在国内太火了，都想做2代测序的应用，但很多对于实验设计和分析都是估计不足的。所以希望在这些方面能够对大家有些帮助

[ Last edited by genomelin on 2011-4-6 at 15:15 ]
赞一下(2人) 回复此楼
5楼2011-04-06 15:01:26
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

智能机器人

Robot (super robot)

我们都爱小木虫

找到一些相关的精华帖子，希望有用哦~

科研从小木虫开始，人人为我，我为人人

rb

木虫 (著名写手)

小笨虫虫
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
看天(EPI+1): 鼓励分享自己的实验经历 2011-04-06 18:19:33
06年自己做这方面工作时候的一个情况。后来很少接触。（直接copy过来了不再编辑了，少了一些图片）

I 原理简介：
        测序引物与单链PCR扩增的DNA模板相结合。然后将其与DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶，以及底物APS和荧光素一起孵育。
        四种dNTP（dATP，dTTP，dCTP，dGTP）之一被加入反应体系，如与模扳配对（A—T，C—G），此dNTP与引物的末端形成共价键，dNTP的焦磷酸基团（PPi）释放出来。而且释放出来的Ppi的量与和模板结合的dNTP的量成正比。
         ATP硫酸化酶在腺苷酰硫酸存在的情况下催化PPi形成ATP，ATP驱动荧光素酶介导的萤光素向氧合萤光素的转化，氧合萤光素发出与ATP量成正比的可见光信号。光信号由CCD摄像机检测并由pyrogram™反应为峰。每个光信号的峰高与反应中掺入的核苷酸数目成正比。
        ATP和未掺入的dNTP由三磷酸腺苷双磷酸酶降解，淬灭光信号，并再生反应体系。
        然后加入下一种dNTP。最终待测序列顺序，即可从反应光强的信号峰中读出。在此过程之中有几点值得注意的是，在体系中使用的是dATP S而非dATP，因为dATP S不是荧光素酶的底物，而且DNA聚合酶对dATP S的催化效率更高。而且在系统之中，底物的浓度已经最佳化，使得dNTP的降解速度慢于它的掺入速度，ATP的合成速度快于水解速度，其中三磷酸腺苷双磷酸酶的特异浓度，可以保证降解完全，使系统复原。

II 操作步骤：
        在使用前，保证所有溶液都达到室温；
        在PSQ 96板中预先加入45μl含有0.3μM测序引物的annealing buffer；
        使用Vertex混匀Sepharose beads；
        将需要使用的sepharoe beads总量（每样本3μl）转移到一个Eppendorf管中；
        在sepharose bead中加入binding buffer，使得平均每个样品约有50μl的体积，将混合物混匀；
        将以上混合物加入PCR产物（50μl反应体积）中，每样本50μl；
        将PCR产物在常温下混匀10分钟，使得beads与生物素结合，对于较长片段，可适当延长混匀时间；
        在Vacuum prep workstation中，四个样品板中依次加入180ml高纯水、70％乙醇、washing buffer和120ml Denaturation buffer；
        打开vacuum prep workstation的泵，将vacuum prep tool在高纯水中清洗30秒；
        然后将vacuum prep tool移到PCR板中，抓取sepharose beads（请在beads与PCR产物结合后三分钟内完成此操作）；
        拿起PCR板，检查是否大部分beads都被吸附在了vacuum prep tool上；
        将vacuum prep tool放入70％乙醇中5秒；
        然后移到denatureation buffer中5秒；
        再移到washing buffer中清洗5－10秒；
        关掉泵；
        将vacuum prep tool放入含有测序引物的板中，摇动，释放sepharose beads（测序引物也可最后加入）
        使用高纯水清洗vacuum prep tool；
        将放有样品的PSQ 96板放在ThermoPlate上加热到80℃ 2分钟，再冷却到室温，即可进行Pyrosequencing反应。
赞一下(4人) 回复此楼
寝室楼的大爷、大妈都是哲学家，他们每天都在思考人类最根本的三个问题：你是谁？你从哪儿来？要去哪儿？
6楼2011-04-06 15:39:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 JessieDai 的主题更新
21/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[职场人生] 40+中年人失业后，还能找到好工作吗？ +11 xqy2009 2026-10-13 13/650 2026-10-15 21:32 by bear2007
[有机交流] 用NBS溴化时溶剂除了CCl4外还有什么 +3 18834002860 2026-10-12 6/300 2026-10-15 14:30 by 长沙摩尔信息科�
[基金申请] 申请科研项目纯靠实力能成功吗？ 200+7 David1982 2026-10-13 11/550 2026-10-15 10:30 by zyqchem
[硕博家园] 极限拉扯，如何抉择 +11 Isak0320 2026-10-12 15/750 2026-10-14 21:55 by 猫鱼不是鱼
[论文投稿] 二审4个多月了还是Awaiting Reviewer Scores 10+3 纳斯达克ML 2026-10-11 4/200 2026-10-14 17:30 by babero
[有机交流] OpenAI又攻克数学难题了，离AI做有机合成还有多远？ +8 wangyl_123 2026-10-10 13/650 2026-10-14 15:12 by zuesli
[教师之家] 课题组会帮你通过考核么？ +4 好运来～9527 2026-10-10 7/350 2026-10-13 08:41 by xli1984
[公派出国] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +5 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 9/450 2026-10-11 22:34 by XQNyDCa1Tk5n
[找工作] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +5 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 8/400 2026-10-11 22:26 by XQNyDCa1Tk5n
[公派出国] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +5 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 10/500 2026-10-11 22:26 by XQNyDCa1Tk5n
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +5 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 9/450 2026-10-11 22:15 by XQNyDCa1Tk5n
[教师之家] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 (EPI+-1)(金币-50) +5 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 10/500 2026-10-11 22:06 by XQNyDCa1Tk5n
[教师之家] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 (EPI+-1)(金币-50) +5 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 10/500 2026-10-11 14:25 by VOMexwnDzOFZ
[教师之家] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 (EPI+-1)(金币-50) +4 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 7/350 2026-10-11 14:05 by VOMexwnDzOFZ
[考研] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +5 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 8/400 2026-10-11 13:51 by VOMexwnDzOFZ
[硕博家园] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +5 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 8/400 2026-10-11 13:45 by VOMexwnDzOFZ
[找工作] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +3 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 7/350 2026-10-11 10:54 by VOMexwnDzOFZ
[找工作] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +4 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 7/350 2026-10-11 10:34 by VOMexwnDzOFZ
[考博] 招收博士生一名 +3 mandolin 2026-10-10 3/150 2026-10-11 10:21 by 不是山谷！
[公派出国] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急 +4 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 4/200 2026-10-11 03:14 by M0zrYVSAnxpE
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭