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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR好多次了，一直没结果，麻烦各位帮我看看是哪出问题了？
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一杯清茶puma

铁虫 (初入文坛)

[求助] PCR好多次了，一直没结果，麻烦各位帮我看看是哪出问题了？已有1人参与

这是我PCR后的琼脂糖电泳图，2%的 胶，跑了15分钟，120V。DNA模板是提取出来后在4度放了10多天的，引物是新和成的。25UL的体系，DNA 加了3UL.麻烦各位给我分析一下是哪出问题了？？？？？？毕业论文，很急啊，，大侠们帮帮忙吧！！！
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1楼2012-05-27 22:16:26
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一杯清茶puma

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by jingdejun at 2012-05-28 09:19:59
引物不用检查有没有问题，直接换一管新的就可以了（不要说你没分装啊）。因为一般合成一次引物的量，做个几百次是没问题的，要是怀疑引物出了问题，就直接换新的，引物绝对够的。

至于胶的浓度，它与所跑的DN ...

引物是按单子上说的稀释的。。。下次制胶的时候我一定小心点。谢谢啦。。
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10楼2012-05-28 12:40:30
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查看全部 16 个回答

孙启亮

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
楼主确定你的引物可用吗？看图的话感觉条带弥散，有二聚体。理论上讲DNA模板放10天是没有问题的呀
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2楼2012-05-27 22:55:20
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maoyong

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-28 15:56:44
楼主你要注意两方面的问题：
(1)检测DNA模板的浓度和纯度，是否发生降解；
(2)引物是哪种，如果是特异引物的话就需要重新设计了，没有特异带，另外可以做个梯度试试。
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3楼2012-05-27 23:21:50
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chiden

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+5, 恩，分析的很全面哦 2012-05-29 13:50:42
西瓜: MolEPI+1, Good！ 2012-05-31 09:34:34
看上面的电泳图的话，应该不是特异引物吧，二聚体的带都不明显。
一般来说如果是模板的问题，那么重复了多次的PCR产物中，二聚体的带应该是有比较好的，比较亮的不会跑的这么难看。
PCR扩增不出来，问题可能是多方面的。
1、确认模板DNA是否真的有DNA。这个检测的方法有很多，简单的就是用直接用模板DNA跑电泳，取个3UL，有带存在表明DNA确实有，当然这个条带的亮度就和DAN浓度的高低有关了。有可能是一条很淡的条带，要仔细看。DNA在4度可以保存两个多月没问题的，放心。
2、检查体系比例是否有问题。
3、检查PCR扩增条件设置是否正确，就像上面前辈说的，设个梯度。
4、检查引物是否仍然存在，如有要及时更换。
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即使难过，也要微笑着走下去
4楼2012-05-27 23:35:59
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