| 查看: 1693 | 回复: 7 | |||||
echochen1017新虫 (初入文坛)
|
[求助]
PCR重复不出来
|
| 之前在3月份PCR除了结果，并测序，现在重复，已经重复5天，没有任何条带，调高、调低模板浓度，并且在冰上加样，也没有目的条带，低浓度样品在500bp左右出现非特异性条带，请教这是什么情况呢？ |
回复此楼» 猜你喜欢
不合理蛙科研实验中的趣事：实验器材的 “乌龙”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：和实验材料的 “斗智斗勇”
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有58人回复
-
蛋白质检测：精准分析，解锁生物分子的密码
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之小鼠实验：严谨设计，解析生命机制的重要载体
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之重金属检测：精准筛查，守护健康与环境的防线
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
-
纳米粒度分析
已经有3人回复
-
林科院林化所招收材料与化工专业硕士，坐标南京
已经有0人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 一直都能PCR出来的产物，怎么重复不出来了
已经有11人回复
- 单个碱基突变的PCR条件如何优化
已经有11人回复
- 崩溃了 难题 跪求解答：质粒提不出，酶切切不开
已经有30人回复
- 请教一下，这是否为假阳性克隆的问题，如果是，该如何提高阳性克隆效率？
已经有20人回复
- 线粒体基因控制区CR含重复序列，为什么PCR产物直接测序不准，而要纯化或者克隆再测序
已经有12人回复
- PCR批出非目标带，空白对照都有，重复进行，有时有，有时没有，咋回事？
已经有8人回复
- RT-PCR的cDNA不能扩增出目的条带，只有内参基因能扩增出来
已经有14人回复
- PCR好多次了，一直没结果，麻烦各位帮我看看是哪出问题了？
已经有15人回复
- 菌液PCR没东西，但是提完质粒能跑出来条带，为什么啊？
已经有16人回复
- PCR重复不出来
已经有20人回复
- 求解释这pcr是啥问题，帮同学问的^_^
已经有29人回复
- 转基因植物检测
已经有13人回复
- RCR自己怎么都做不出来，但是同样条件下师哥帮着做了，却出来了，求助原因
已经有41人回复
- 请教：菌液pcr带总是很弱，为什么？
已经有3人回复
- PCR, southern 转基因植物阳性检测
已经有4人回复
- 【求助/交流】请教个关于inverse PCR的问题
已经有21人回复
- 【求助/交流】为什么PCR引物不能反复冻融？后果会是怎样
已经有20人回复
- 【求助/交流】5'Race反复做不出来，该怎么办
已经有74人回复
- 【求助/交流】PCR重复不出来，怎么回事？
已经有27人回复
凌波丽
专家顾问 (知名作家)
-
专家经验: +218 - MolEPI: 44
- 应助: 397 (硕士)
- 贵宾: 0.044
- 金币: 2118.9
- 散金: 10
- 红花: 208
- 帖子: 5633
- 在线: 571.6小时
- 虫号: 1766465
- 注册: 2012-04-19
- 性别: MM
- 专业: 生物大分子结构与功能
- 管辖: 生物科学综合
【答案】应助回帖
★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-06-09 22:04:32
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-06-09 22:04:32
|
你的PCR出现非特异性扩增带和可重复性低本质就是你的PCR的专一性不够。 PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带 与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、 或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶 则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。 其对策有：首先可以调整镁离子的浓度， 由5.0mmol/L起以0.05mmol/L为单位逐渐下降至1.0mmol/L，降低镁离子的浓度无效的话，也可以提高镁离子浓度，最高不超过10.0mmol/L.调整引物浓度（你的非特异性扩增多，因此应适当降低引物浓度），适当增加模板量，减少循环次数。减低酶量或调换另一来源的酶。适当提高退火温度。 使用热启动的PCR.可用石蜡隔离方式：先放引物、模板、缓冲溶液（以上称为A液）入PCR管，然后加入固体石蜡，75度水浴PCR管5分钟，目视石蜡完全融化后拿PCR管出水浴锅室温下竖直放置约15分钟，待石蜡重新凝固为固体层后，在石蜡层上加入聚合酶、dNTP、MgCl2、缓冲溶液（以上称为B液），也就是使固体石蜡层隔离A液与B液在PCR管的上下两层。反应开始后，石蜡再度熔化，反应体系形成。每种调整均可以分梯度进行。 一般商用的酶制剂里都还有甘油，酶的用量较大时最好是事先超滤或者透析去除一些甘油。 加入0.01%的BSA，白明胶或者Tritom X-100.也有助于提高PCR反应的专一性和可重复性。以上都不行则要重新设计引物。 另外，时机最好用新鲜的，操作注意防止污染。 |
2楼2013-06-08 17:25:06
zhoulubin
银虫 (小有名气)
- 应助: 26 (小学生)
- 金币: 687.8
- 帖子: 122
- 在线: 70.9小时
- 虫号: 1215331
- 注册: 2011-02-27
- 性别: GG
- 专业: 植物遗传学
3楼2013-06-09 09:36:20
凌波丽
专家顾问 (知名作家)
-
专家经验: +218 - MolEPI: 44
- 应助: 397 (硕士)
- 贵宾: 0.044
- 金币: 2118.9
- 散金: 10
- 红花: 208
- 帖子: 5633
- 在线: 571.6小时
- 虫号: 1766465
- 注册: 2012-04-19
- 性别: MM
- 专业: 生物大分子结构与功能
- 管辖: 生物科学综合
4楼2013-06-10 01:46:57
凌波丽
专家顾问 (知名作家)
-
专家经验: +218 - MolEPI: 44
- 应助: 397 (硕士)
- 贵宾: 0.044
- 金币: 2118.9
- 散金: 10
- 红花: 208
- 帖子: 5633
- 在线: 571.6小时
- 虫号: 1766465
- 注册: 2012-04-19
- 性别: MM
- 专业: 生物大分子结构与功能
- 管辖: 生物科学综合
5楼2013-06-10 01:49:31
starseacow
专家顾问 (职业作家)
-
专家经验: +426 - MolEPI: 3
- 应助: 1217 (讲师)
- 金币: 9097.3
- 散金: 16445
- 红花: 226
- 帖子: 4669
- 在线: 2320.2小时
- 虫号: 1136974
- 注册: 2010-11-02
- 性别: GG
- 专业: 植物生理与生化
- 管辖: 动植物
6楼2013-06-10 03:57:57
zhoulubin
银虫 (小有名气)
- 应助: 26 (小学生)
- 金币: 687.8
- 帖子: 122
- 在线: 70.9小时
- 虫号: 1215331
- 注册: 2011-02-27
- 性别: GG
- 专业: 植物遗传学
7楼2013-06-10 16:06:59
learningying
铁杆木虫 (著名写手)
- 应助: 8 (幼儿园)
- 金币: 5431.9
- 散金: 323
- 红花: 33
- 帖子: 1074
- 在线: 256.6小时
- 虫号: 2055341
- 注册: 2012-10-11
- 性别: GG
- 专业: 生物化学
8楼2014-10-27 19:54:48
10