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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 请帮忙分析一下提取RNA遇到的问题
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18988582

银虫 (正式写手)

[求助] 请帮忙分析一下提取RNA遇到的问题

我实验室的Trizol提取RNA，氯仿分层以后，提取上清液，加入异丙醇时，出现大量浑浊悬浮白色沉淀，而且离心后发现管底有一大坨白色物质，量很大，应该不是RNA那种透明的胶状沉淀。这个沉淀很难溶解，我加了500微升的水才完全溶解。
    我以前提的效果很好，不知道这几次到底是什么原因？请帮忙分析一下！


另外，我又买promega试剂盒Z3100，提取RNA，效果也不是很好，我的下游主要是做PCR。
我以前提的效果很好，不知道这几次到底是什么原因？请帮忙分析一下！


电泳图见附件，第2，3泳道是用Trizol提的，4，5泳道是用试剂盒提的！
如果做PCR的话，后两个泳道的RNA可以用吗？可以直接进行一步法PCR吗？

谢谢！
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1楼 2012-07-16 19:31:38
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小虫子666

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, MolEPI+1, 鼓励热心的虫虫，积极交流经验 2012-07-18 13:53:40
12泳道也不是完全降解，降解的话应该弥散的带，你这个还能看到2条主带，3 4泳道，我认为完全可以做反转录，做PCR。
下面是我用trizol提植物RNA的一些建议：
用trizol提的时候，加入trizol后充分裂解，离心裂解破碎的细胞杂质， 吸上清后，再加氯仿抽取，再加异丙醇沉淀。如果认为杂质还是很多，可以重复用氯仿抽取数次，然后再沉淀。最后一次氯仿抽提，吸上清切记不用洗到中间层。沉淀RNA，离心后，若不见胶状沉淀，也不要认为RNA没有，用30微升DEPC水反复吹打并冲洗管壁。   
是提植物RNA吗？ 研磨的样品可以多点，1.5ml管我一般是装到0.3-0.5ml 加1ml trizol  我做的是大豆 根茎叶 种子用trizol 都有不错的结果 。 根 茎 trizol 最好提了。 物种不同方法也不同用的RNA试剂也不同，棉花高酚的用trizol 就不行。自己再多试试吧。
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7楼2012-07-17 11:02:59
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shenye.judy

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+2, 鼓励新虫发帖交流，欢迎常来生物医药区 2012-07-16 20:17:20
1.2两个是降解了，小分子量的地方很亮
3,4你可以试试，至少没怎么降解。
你说原来提的好，是一样的材料吗？不同的材料需要用不同的提取方法。
我以前提植物根，用trizol，结果最后出来很多难溶的白色沉淀，我用低速离心把白色弄成沉淀，吸取上清跑RNA也是能跑出来可以用的条带，一般来说是蛋白污染。
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2楼2012-07-16 19:39:51
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普通回帖

yuzengyang

新虫 (初入文坛)
跟老板说说买PCR仪吧
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3楼2012-07-16 19:56:31
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18988582

银虫 (正式写手)
我用的是动物的性腺组织
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4楼2012-07-16 20:03:57
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18988582

银虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by yuzengyang at 2012-07-16 19:56:31
跟老板说说买PCR仪吧

我们实验室什么都有啊，这与PCR有什么关系
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5楼2012-07-16 20:04:32
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18988582

银虫 (正式写手)
高手在哪里
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6楼2012-07-17 08:46:22
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xw19880905

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
后面两个应该可以做，一般我们做只需要前面两条带。你用trizol提取时，建议加氯仿后，宁可少去上清液也不要污染，1000微升的trizol月600就够了
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8楼2012-07-17 11:07:08
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18988582

银虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by xw19880905 at 2012-07-17 11:07:08
后面两个应该可以做，一般我们做只需要前面两条带。你用trizol提取时，建议加氯仿后，宁可少去上清液也不要污染，1000微升的trizol月600就够了

我已经很小心的吸取上清了

为啥后面两个也只有一条带呢
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9楼2012-07-17 11:11:04
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nmhsd

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-07-18 13:53:51
提RNA一般注意一点，就是吸取上清时，宁缺毋滥，尽量少去一些，决不能吸到中间层。一般Trizol就能胜任，植物中，我提过兰花的，草莓的，枣树的等，动物细胞sf-9的，及其他一些昆虫，都能做出下游普通的RT-PCR实验
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10楼2012-07-18 00:04:35
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