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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR反应体系求助
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lpsyz007

新虫 (小有名气)

[求助] PCR反应体系求助

本科菜鸟PCR个人用的的是20（单位微升）的体系大概是BUFFER 2.0 dNTPs 0.4 Tap 0.4 正反引物 2 模板DNA 1.2 水 14.这是我用的 最后老师说这个体系做不出，我看了一下老师的体系BUFFER 2.0 dNTPs 0.3 Tap 0.5 正反引物 2 模板DNA 2 水 13.2.求高手给个解释啊！！！！！我的体系是什么问题？？？
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1楼2012-07-16 10:23:21
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eargle

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-07-16 13:54:11
你的PCR体系DNA还是要加到2ul，你在配你的PCR反应体系时，不要光看别人的体系，还要看他加那些材料的浓度是多少，不能盲目照搬。
你若用20ul的反应体积，BUFFER（加Mg) 2.5  dNTPs 0.5  Tap 0.4 正反引物 各1  模板DNA 2 水 12.6.  可以试一下
一般PCR反应用25ui的比较多些，也有用50ul的。
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结识每个虫友，将是我的又一大荣幸！
2楼2012-07-16 12:33:41
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lpsyz007

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by eargle at 2012-07-16 12:33:41
你的PCR体系DNA还是要加到2ul，你在配你的PCR反应体系时，不要光看别人的体系，还要看他加那些材料的浓度是多少，不能盲目照搬。
你若用20ul的反应体积，BUFFER（加Mg) 2.5  dNTPs 0.5  Tap 0.4 正反引物 各1  模板 ...

dNTPs和Tap的量比如有什么比例之类的 还有就是正反引物和模板DNA要一样？？这是为什么呢？
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3楼2012-07-16 20:35:47
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84146922

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-07-18 13:48:00
购买的酶的公司网站应该有酶的说明书，不过个人觉得，模板还是加少点，之前试过模板加多，后来减少模板，杂带会明显减少，现在一直都是加20纳克/微升，这只是我的做法，希望对你有帮助。
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4楼2012-07-17 07:27:51
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jl860822

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我感觉你的引物和模板都加的有点多，会影响你的实验结果
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5楼2012-07-17 08:59:20
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reallpf

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励交流 2012-07-18 13:48:13
引用回帖:
3楼: Originally posted by lpsyz007 at 2012-07-16 20:35:47
dNTPs和Tap的量比如有什么比例之类的 还有就是正反引物和模板DNA要一样？？这是为什么呢？...

引物并不是要和模版一样，这个只能说是你的体系刚好一样。另外2着也没有太多的关系，主要的是酶和dNTP够用就好，当然浓度也不能太大。PCR体系是要靠自己摸索的，而不是单纯的去做自己或别人（即使是老师）给的体系。
实验都是要靠自己去探索，不要过于的纠结别人的条件。根据自己的实验结果再交流讨论优化PCR体系和条件就好。
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lpsyz007
6楼2012-07-17 09:12:15
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lpsyz007

新虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
6楼: Originally posted by reallpf at 2012-07-17 09:12:15
引物并不是要和模版一样，这个只能说是你的体系刚好一样。另外2着也没有太多的关系，主要的是酶和dNTP够用就好，当然浓度也不能太大。PCR体系是要靠自己摸索的，而不是单纯的去做自己或别人（即使是老师）给的体系 ...

谢谢
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7楼2012-07-18 10:30:05
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renzhiq

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

你们是什么学校，什么老师？给你个正确的体系：BUFFER 2.0，dNTPs 1.6（2.5 each），Taq 0.2（5U）， 正反引物1（10uM）， 模板DNA 0.5， 水 up to 20.
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8楼2013-05-01 20:45:32
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dafeizizhu

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
2楼: Originally posted by eargle at 2012-07-16 12:33:41
你的PCR体系DNA还是要加到2ul，你在配你的PCR反应体系时，不要光看别人的体系，还要看他加那些材料的浓度是多少，不能盲目照搬。
你若用20ul的反应体积，BUFFER（加Mg) 2.5  dNTPs 0.5  Tap 0.4 正反引物 各1  模板 ...

buffer必须按照规定稀释，我们使用的是25ul体系，模板50-150ng，正反引物各1，buffer2.5，dNTP0.5，taq 0.2（1个单位），剩下的用水补充到25ul
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9楼2013-05-02 10:42:39
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nmhsd

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

如果是国产试剂做不出来，建议把酶提高到推荐用量的2-3倍，如果还出不来，还试剂吧
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10楼2013-05-02 11:07:06
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