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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】PCR反应体系请教！
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hnndpt

铁虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】PCR反应体系请教！ 已有10人参与

最近在扩增基因，用如下程序，扩好多次都没结果，只有引物2聚体，大家帮看下反应程序有无问题。
   
                    水： 12.2微升
                    10*buffer： 2微升
                    DNTP:2微升
                    引物F（5PM）: 0.8微升
                      引物R（5PM）: 0.8微升
                       Taq:  0.2微升
                       CDNA模板：2微升
早上来老板说酶加少了，应该加2微升，引物应该提高到4微升。排队等PCR仪中，哪位高人看下，体系还有什么需要优化的？
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1楼 2010-12-27 09:18:21
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jerry110

新虫 (小有名气)
★
dhd997(金币+1):鼓励经验交流 2010-12-28 09:02:27
我们是25微升的体系，但是酶只加0.5微升啊，不知道你们是怎样的，扩不出来可以调节一下其他的量
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2楼2010-12-27 10:00:25
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hclcarl

铁虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by hnndpt at 2010-12-27 09:18:21:
最近在扩增基因，用如下程序，扩好多次都没结果，只有引物2聚体，大家帮看下反应程序有无问题。
   
                    水： 12.2微升
                    10*buffer： 2微升
                    DNTP:2微 ...

应该把各种组分的浓度加上吧 我们实验室用的是宝生物的Taq酶 25ul的体系加0.125ul的Taq酶
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3楼2010-12-27 10:13:22
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hnndpt

铁虫 (正式写手)
[quote]Originally posted by hclcarl at 2010-12-27 10:13:22:

应该把各种组分的浓度加上吧 我们实验室用的是宝生物的Taq酶 25ul的体系加0.125ul的Taq酶 [/quote


我们用的酶是老板的同学实验室自己做的，所以浓度也不太清楚！
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4楼2010-12-27 10:16:47
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武荷花S

新虫 (小有名气)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
dhd997(金币+2):谢谢交流 2010-12-28 09:02:49
把各成分浓度标上
一般扩不出条带 很大原因是模板和引物
如果是通用引物 模板是否讲解
如果是自己设计的 建议重新设计引物
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5楼2010-12-27 10:20:24
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hnndpt

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 武荷花S at 2010-12-27 10:20:24:
把各成分浓度标上
一般扩不出条带 很大原因是模板和引物
如果是通用引物 模板是否讲解
如果是自己设计的 建议重新设计引物

引物是根据已知的基因序列设计的，因为要克隆CDS序列，所以就在编码区两端设计引物，前加酶切位点和保护碱基。共9个基因设计了引物，55度退火扩增，一条带也没出来，请看一下引物浓度低吗？我扩出来只有引物2聚体，是否说明引物够用？  我扩的长度9个基因都在1000-1500bp之间
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6楼2010-12-27 10:25:02
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hnndpt

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 武荷花S at 2010-12-27 10:20:24:
把各成分浓度标上
一般扩不出条带 很大原因是模板和引物
如果是通用引物 模板是否讲解
如果是自己设计的 建议重新设计引物

另外我们的酶是自己做的，别人用来扩拟南芥400-600bp的片段可以扩出来，20微升体系加0.2微升，你看我这个酶是不是加的少了？
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7楼2010-12-27 10:26:23
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可可猫

铜虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
我们也是25微升体系

酶只加0.2微升  宝生物的taq酶
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8楼2010-12-27 10:29:06
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mysins

金虫 (正式写手)
★
dhd997(金币+1):谢谢交流 2010-12-28 09:03:09
拟南芥400-600bp的片段可以扩出来
你的片段比较长。另外可以考虑做个梯度摸一下温度。
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厚积薄发，博观约取。
9楼2010-12-27 12:16:58
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yj-lzx

荣誉版主 (文坛精英)

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★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
dhd997(金币+1):欢迎回帖交流 2010-12-28 09:03:23
体系没啥问题吧~~~一般都是引物的问题~~~
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曾经的你/以为只要带着那把青春的长剑和赤子的良心就可以说服自己不出卖理想的灵魂/在最寂寞和不得不流泪的晚上/即使连自己都在笑自己傻/依然拔出怀中的长剑~~~
10楼2010-12-27 15:09:39
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