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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】PCR反应体系请教！
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hnndpt

铁虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】PCR反应体系请教！ 已有10人参与

最近在扩增基因，用如下程序，扩好多次都没结果，只有引物2聚体，大家帮看下反应程序有无问题。
   
                    水： 12.2微升
                    10*buffer： 2微升
                    DNTP:2微升
                    引物F（5PM）: 0.8微升
                      引物R（5PM）: 0.8微升
                       Taq:  0.2微升
                       CDNA模板：2微升
早上来老板说酶加少了，应该加2微升，引物应该提高到4微升。排队等PCR仪中，哪位高人看下，体系还有什么需要优化的？
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1楼 2010-12-27 09:18:21
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hnndpt

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 武荷花S at 2010-12-27 10:20:24:
把各成分浓度标上
一般扩不出条带 很大原因是模板和引物
如果是通用引物 模板是否讲解
如果是自己设计的 建议重新设计引物

引物是根据已知的基因序列设计的，因为要克隆CDS序列，所以就在编码区两端设计引物，前加酶切位点和保护碱基。共9个基因设计了引物，55度退火扩增，一条带也没出来，请看一下引物浓度低吗？我扩出来只有引物2聚体，是否说明引物够用？  我扩的长度9个基因都在1000-1500bp之间
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6楼2010-12-27 10:25:02
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jerry110

新虫 (小有名气)
★
dhd997(金币+1):鼓励经验交流 2010-12-28 09:02:27
我们是25微升的体系，但是酶只加0.5微升啊，不知道你们是怎样的，扩不出来可以调节一下其他的量
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2楼2010-12-27 10:00:25
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hclcarl

铁虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by hnndpt at 2010-12-27 09:18:21:
最近在扩增基因，用如下程序，扩好多次都没结果，只有引物2聚体，大家帮看下反应程序有无问题。
   
                    水： 12.2微升
                    10*buffer： 2微升
                    DNTP:2微 ...

应该把各种组分的浓度加上吧 我们实验室用的是宝生物的Taq酶 25ul的体系加0.125ul的Taq酶
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3楼2010-12-27 10:13:22
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hnndpt

铁虫 (正式写手)
[quote]Originally posted by hclcarl at 2010-12-27 10:13:22:

应该把各种组分的浓度加上吧 我们实验室用的是宝生物的Taq酶 25ul的体系加0.125ul的Taq酶 [/quote


我们用的酶是老板的同学实验室自己做的，所以浓度也不太清楚！
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4楼2010-12-27 10:16:47
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