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[求助]
RAPD标记有问题，虚心请教。。。。
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条件优化结束，确定体系后，已经开始做多态性了。但做了几个引物就出问题了，找了很久，也不知道是什么原因，求教高手。 图1（做的比较好） 图2 （从某一天开始，所有的多态性都跟这个差不错，背景特别亮） 紧急呼救啊。。。   图2  图1 [ Last edited by 墨池 on 2011-11-30 at 10:11 ] |
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【答案】应助回帖
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amisking(金币+3, MolEPI+1): 鼓励发帖交流。 2011-11-30 18:28:57
amisking(金币+3, MolEPI+1): 鼓励发帖交流。 2011-11-30 18:28:57
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RAPD技术是建立在PCR技术的基础上，它用一系列(通常数百个)不同的随机排列碱基序列的寡核苷酸单链(一般为10个bp)作为引物，对所研究的基因组DNA进行单引物扩增。模板DNA经90—94变性 解链后在较低温度(36～37℃)下退火，这时形成的单链模板会有许多位点与引物互补配对，在 72℃下，通过链延伸，形成双链结构，完成DNA合成。重复上述过程，即可产生片段大小不等的扩增产物，通过电泳分离和显色便可得到许多不同的条带，从中 筛选出特征性条带。扩增产物片段的多态性反映了基因组DNA的多态性。如果基因组在这些区域内发生DNA片段插入、缺失或碱基突变就可能导致这些特定结合 位点的分布发生相应的变化，而使PCR产物增加、缺少或发生分子量的改变。因此，通过对PCR产物的检测即可测出基因组DNA在这些区域的多态性。进行 RAPD分析时，可用引物的数量很大，虽然对每个引物而言，其检测基因组DNA多态性的区域是有限的，但是利用一系列引物则可以使检测区域几乎覆盖整个基 因组。因此，RAPD可以对整个基因组DNA进行多态性检测。 RAPD技术的优点： ①不使用同位素，减少了对工作人员健康的危害； ②可以在物种没有任何分子生物学研究 的情况下分析其DNA多态性； ③对模板 DNA的纯度要求不高； ④技术简单，无需克隆DNA探针，无需进行分子杂交； ⑤灵敏度高，可提供丰富的多态性； ⑥RAPD引物没有严格的种属界限，同一套 引物可以应用于任何一种生物的研究，因而具有广泛性、通用性。 但是，RAPD技术较易受到各种因素的影响。无论是模板的质量和浓度，短的引物序列，PCR的循环次数，基因组DNA的复杂性，技术设备等，都有可 能是RAPD技术重复性差的直接原因。目前，多从以下几个方面来提高反应的稳定性： ①操作规范，反应体系的组成要力求一致，尽可能地使RAPD反应标准 化； ②提高扩增片段的分辨率； ③将RAPD标记转化为SCAR标记后再进行常规的PCR分析，可以提高反应的稳定性及可靠性。 |
3楼2011-11-30 10:45:40
2楼2011-11-30 10:43:03
bluysky0902
金虫 (正式写手)
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4楼2011-11-30 10:50:45
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