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墨池

银虫 (小有名气)

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[求助] RAPD标记有问题，虚心请教。。。。

条件优化结束，确定体系后，已经开始做多态性了。但做了几个引物就出问题了，找了很久，也不知道是什么原因，求教高手。
图1（做的比较好）
图2 （从某一天开始，所有的多态性都跟这个差不错，背景特别亮）

紧急呼救啊。。。

图2

图1

[ Last edited by 墨池 on 2011-11-30 at 10:11 ]

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阳光暖暖的，心情暖暖的，努力做个精致的女人！

1楼 2011-11-30 10:09:19

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航航宝贝

银虫 (正式写手)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★
amisking(金币+3, MolEPI+1): 鼓励发帖交流。 2011-11-30 18:28:57

RAPD技术是建立在PCR技术的基础上，它用一系列(通常数百个)不同的随机排列碱基序列的寡核苷酸单链(一般为10个bp)作为引物，对所研究的基因组DNA进行单引物扩增。模板DNA经90—94变性解链后在较低温度(36～37℃)下退火，这时形成的单链模板会有许多位点与引物互补配对，在 72℃下，通过链延伸，形成双链结构，完成DNA合成。重复上述过程，即可产生片段大小不等的扩增产物，通过电泳分离和显色便可得到许多不同的条带，从中筛选出特征性条带。扩增产物片段的多态性反映了基因组DNA的多态性。如果基因组在这些区域内发生DNA片段插入、缺失或碱基突变就可能导致这些特定结合位点的分布发生相应的变化，而使PCR产物增加、缺少或发生分子量的改变。因此，通过对PCR产物的检测即可测出基因组DNA在这些区域的多态性。进行 RAPD分析时，可用引物的数量很大，虽然对每个引物而言，其检测基因组DNA多态性的区域是有限的，但是利用一系列引物则可以使检测区域几乎覆盖整个基因组。因此，RAPD可以对整个基因组DNA进行多态性检测。

RAPD技术的优点：
①不使用同位素，减少了对工作人员健康的危害；
②可以在物种没有任何分子生物学研究的情况下分析其DNA多态性；
③对模板 DNA的纯度要求不高；
④技术简单，无需克隆DNA探针，无需进行分子杂交；
⑤灵敏度高，可提供丰富的多态性；
⑥RAPD引物没有严格的种属界限，同一套引物可以应用于任何一种生物的研究，因而具有广泛性、通用性。

但是，RAPD技术较易受到各种因素的影响。无论是模板的质量和浓度，短的引物序列，PCR的循环次数，基因组DNA的复杂性，技术设备等，都有可能是RAPD技术重复性差的直接原因。目前，多从以下几个方面来提高反应的稳定性：
①操作规范，反应体系的组成要力求一致，尽可能地使RAPD反应标准化；
②提高扩增片段的分辨率；
③将RAPD标记转化为SCAR标记后再进行常规的PCR分析，可以提高反应的稳定性及可靠性。