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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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faile18

金虫 (小有名气)

[求助] 求助PCR反应参数设置

求助各位PCR反应过程中,各个阶段参数设置的问题,有没有一些参考依据,大致的范围都可以找到,但细节需要精确,望各位赐教!
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love_st

金虫 (著名写手)


【答案】应助回帖

faile18(金币+1): 2011-09-06 10:05:41
哎,目的不明确,你说的都不细,别人怎么细说
2楼2011-08-30 17:30:32
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faile18

金虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by love_st at 2011-08-30 17:30:32:
哎,目的不明确,你说的都不细,别人怎么细说

不好意思,昨晚发帖发的仓促了。退火温度我是根据引物合成订单上面的温度来计算设计的。比如说我的基因大小有1000以下的,1000多的,2000多的,3000多的,这些基因的变性时间,退火时间以及延伸时间,这些应该如何设置
3楼2011-08-31 15:27:10
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瓶儿花

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
dhd997(金币+2): 鼓励交流 2011-08-31 17:07:16
faile18(金币+2): 2011-09-06 10:05:55
94℃ 预变性  2-5min
94℃变性     1min
50-60℃退火  1min
72℃延伸     1-2kb/min;30-35个循环
72℃延伸     5-10min
退火温度要根据引物的Tm值来确定,延伸的时间要根据扩增目的片段的大小来确定。
4楼2011-08-31 15:37:11
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wulishu

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
dhd997(金币+2): 鼓励交流 2011-09-01 13:24:50
faile18(金币+2): 2011-09-06 10:06:01
用的什么酶,参看说明书,片段长度不同时一般只需要调节延伸温度就可以

提醒你一句,无论用什么,说明书是必须要参考的
5楼2011-09-01 08:59:24
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wzqno

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


西瓜(金币+1): good 2011-09-01 18:20:02
引用回帖:
4楼: Originally posted by 瓶儿花 at 2011-08-31 15:37:11:
94℃ 预变性  2-5min
94℃变性     1min
50-60℃退火  1min
72℃延伸     1-2kb/min;30-35个循环
72℃延伸     5-10min
退火温度要根据引物的Tm值来确定,延伸的时间要根据扩增目的片段的大小来确定。

退火温度最好先做个预实验,因为基因片段比较长,可以从55-65设10或20个温度梯度,摸索一下  其他的时间参数都好说
6楼2011-09-01 09:14:30
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faile18

金虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 瓶儿花 at 2011-08-31 15:37:11:
94℃ 预变性  2-5min
94℃变性     1min
50-60℃退火  1min
72℃延伸     1-2kb/min;30-35个循环
72℃延伸     5-10min
退火温度要根据引物的Tm值来确定,延伸的时间要根据扩增目的片段的大小来确定。

我现在看的主要是一些材料上提供的范围,主要问题是具体过程中,比如说每个参数,或大或小对产物的影响,以及哪个偏差可能影响不大,而哪一个又会影响较大。
7楼2011-09-01 19:05:04
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faile18

金虫 (小有名气)

引用回帖:
5楼: Originally posted by wulishu at 2011-09-01 08:59:24:
用的什么酶,参看说明书,片段长度不同时一般只需要调节延伸温度就可以

提醒你一句,无论用什么,说明书是必须要参考的

用的是TAKARA的Premix Ex Taq(loading dye),说明书我已经看过了,谢谢。周围的人针对于片段问题,没有提供调节延伸温度的意见
8楼2011-09-01 19:07:40
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wulishu

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
8楼: Originally posted by faile18 at 2011-09-01 19:07:40:
用的是TAKARA的Premix Ex Taq(loading dye),说明书我已经看过了,谢谢。周围的人针对于片段问题,没有提供调节延伸温度的意见

不好意思,写错了,是延伸时间,一般1k bp/min
9楼2011-09-02 09:18:13
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xbl3688

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
dhd997(金币+3): good 2011-09-02 18:25:04
引用回帖:
8楼: Originally posted by faile18 at 2011-09-01 19:07:40:
用的是TAKARA的Premix Ex Taq(loading dye),说明书我已经看过了,谢谢。周围的人针对于片段问题,没有提供调节延伸温度的意见

1、大概的体系前面的虫友都说得差不多了,关于退火温度我也推荐你做一个60-50的温度梯度,程序是前十个循环60℃-50℃,每个循环降一度,这十个循环的延伸时间设为45s或者60s都可以。然后再按照你分析的退火温度延伸25个循环,延伸时间为1k bp/min(片段长的话按比例增加时间);
2、延伸温度一般都使用72℃,没有问题的。
生活的乐趣在于善于发现美,学会欣赏美
10楼2011-09-02 15:30:11
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