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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助PCR反应参数设置
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faile18

金虫 (小有名气)

[求助] 求助PCR反应参数设置

求助各位PCR反应过程中，各个阶段参数设置的问题，有没有一些参考依据，大致的范围都可以找到，但细节需要精确，望各位赐教！
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1楼 2011-08-30 16:48:48
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love_st

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

faile18(金币+1): 2011-09-06 10:05:41
哎，目的不明确，你说的都不细，别人怎么细说
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2楼2011-08-30 17:30:32
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faile18

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by love_st at 2011-08-30 17:30:32:
哎，目的不明确，你说的都不细，别人怎么细说

不好意思，昨晚发帖发的仓促了。退火温度我是根据引物合成订单上面的温度来计算设计的。比如说我的基因大小有1000以下的，1000多的，2000多的，3000多的，这些基因的变性时间，退火时间以及延伸时间，这些应该如何设置
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3楼2011-08-31 15:27:10
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瓶儿花

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
dhd997(金币+2): 鼓励交流 2011-08-31 17:07:16
faile18(金币+2): 2011-09-06 10:05:55
94℃ 预变性  2-5min
94℃变性     1min
50-60℃退火  1min
72℃延伸     1-2kb/min；30-35个循环
72℃延伸     5-10min
退火温度要根据引物的Tm值来确定，延伸的时间要根据扩增目的片段的大小来确定。
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4楼2011-08-31 15:37:11
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wulishu

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
dhd997(金币+2): 鼓励交流 2011-09-01 13:24:50
faile18(金币+2): 2011-09-06 10:06:01
用的什么酶，参看说明书，片段长度不同时一般只需要调节延伸温度就可以

提醒你一句，无论用什么，说明书是必须要参考的
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5楼2011-09-01 08:59:24
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wzqno

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
西瓜(金币+1): good 2011-09-01 18:20:02
引用回帖:
4楼: Originally posted by 瓶儿花 at 2011-08-31 15:37:11:
94℃ 预变性  2-5min
94℃变性     1min
50-60℃退火  1min
72℃延伸     1-2kb/min；30-35个循环
72℃延伸     5-10min
退火温度要根据引物的Tm值来确定，延伸的时间要根据扩增目的片段的大小来确定。

退火温度最好先做个预实验，因为基因片段比较长，可以从55-65设10或20个温度梯度，摸索一下  其他的时间参数都好说
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6楼2011-09-01 09:14:30
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faile18

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 瓶儿花 at 2011-08-31 15:37:11:
94℃ 预变性  2-5min
94℃变性     1min
50-60℃退火  1min
72℃延伸     1-2kb/min；30-35个循环
72℃延伸     5-10min
退火温度要根据引物的Tm值来确定，延伸的时间要根据扩增目的片段的大小来确定。

我现在看的主要是一些材料上提供的范围，主要问题是具体过程中，比如说每个参数，或大或小对产物的影响，以及哪个偏差可能影响不大，而哪一个又会影响较大。
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7楼2011-09-01 19:05:04
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faile18

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by wulishu at 2011-09-01 08:59:24:
用的什么酶，参看说明书，片段长度不同时一般只需要调节延伸温度就可以

提醒你一句，无论用什么，说明书是必须要参考的

用的是TAKARA的Premix Ex Taq（loading dye），说明书我已经看过了，谢谢。周围的人针对于片段问题，没有提供调节延伸温度的意见
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8楼2011-09-01 19:07:40
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wulishu

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
8楼: Originally posted by faile18 at 2011-09-01 19:07:40:
用的是TAKARA的Premix Ex Taq（loading dye），说明书我已经看过了，谢谢。周围的人针对于片段问题，没有提供调节延伸温度的意见

不好意思，写错了，是延伸时间，一般1k bp/min
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9楼2011-09-02 09:18:13
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xbl3688

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
dhd997(金币+3): good 2011-09-02 18:25:04
引用回帖:
8楼: Originally posted by faile18 at 2011-09-01 19:07:40:
用的是TAKARA的Premix Ex Taq（loading dye），说明书我已经看过了，谢谢。周围的人针对于片段问题，没有提供调节延伸温度的意见

1、大概的体系前面的虫友都说得差不多了，关于退火温度我也推荐你做一个60-50的温度梯度，程序是前十个循环60℃-50℃，每个循环降一度，这十个循环的延伸时间设为45s或者60s都可以。然后再按照你分析的退火温度延伸25个循环，延伸时间为1k bp/min（片段长的话按比例增加时间）；
2、延伸温度一般都使用72℃，没有问题的。
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生活的乐趣在于善于发现美，学会欣赏美
10楼2011-09-02 15:30:11
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