| 查看: 2227 | 回复: 8 | |||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | |||
[交流]
酶切酶连转化后单克隆检测不对
|
|||
| 自己构建的载体，片段7K左右；片段（3k）通过PCR扩增；电泳后回收进行酶切，酶切条件37℃，3h；再电泳后回收，酶连时载体：片段=1:1.5左右，转化DH5α，16h（氯霉素抗性）平板上单克隆很多；挑取单克隆进行菌落PCR验证（引物为自己设计），电泳结果显示除了目的条带外还有其他条带；对单克隆培养重新提取质粒进行双酶切后，只检测出一条带（与质粒大小基本一致），没有片段的目的条带。几次转化都如此，求分析，求经验！ |
回复此楼» 猜你喜欢
Wnt-C59：PORCN靶向化学探针，Wnt信号通路阻断机制与科研应用全解析
已经有0人回复
-
Fexaramine：肠道限制性FXR化学探针，结构特征与信号通路研究全解析
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有155人回复
-
NVS-STG2：靶向STING跨膜域的分子胶类激动剂，结构特征与寡聚化机制研究全解析
已经有0人回复
-
DOTA-GPC3肽（CAS 3066439-94-6）：双功能分子探针前体的结构特征与标记应用解析
已经有0人回复
-
科研用 TLR7/8 双激动剂怎么选？现货与质控要点
已经有0人回复
-
SEL120-34A HCl：CDK8/CDK19高选择性激酶抑制剂
已经有0人回复
-
氢氧化钾活化操作
已经有18人回复
-
散金
已经有68人回复
-
生物质超级电容器
已经有0人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 质粒双酶切后回收效率非常低
已经有10人回复
- 关于连接、转化、挑取单克隆的问题
已经有3人回复
- 质粒和片段连接后，酶切验证错误！（求大神指导）
已经有7人回复
- 蓝白斑筛选挑取白色克隆用菌落PCR验证，除目的片段外还有一条带，什么原因？
已经有10人回复
- 酶切连接连不上，要死了
已经有23人回复
- 克隆菌不生长-噬菌体感染？
已经有3人回复
- PET28a重组质粒酶切后有三条？
已经有10人回复
- 单酶切后的载体和目的片段是否都需要去磷酸化
已经有4人回复
- 帮忙看看克隆后检测条带
已经有3人回复
- 做完酶切，之后进行连接，转化，可是过夜之后平板上不长菌落，阴性对照也不长菌落
已经有6人回复
- 挑取单克隆后的PCR验证
已经有3人回复
- XhoI和NcoI双酶切之后连接转化不长克隆
已经有22人回复
- 双酶切转化之后不长菌
已经有5人回复
- 挑单克隆摇不起来
已经有4人回复
- PCR实验结果与酶用量有关吗？
已经有19人回复
- 质粒大小对转化的影响
已经有5人回复
- t载体酶切问题
已经有15人回复
- 酶切、连接和转化
已经有9人回复
- 转化后单克隆都一样吗
已经有13人回复
- 甲基化酶切不完全，怎样设置对照呢？
已经有6人回复
- 克隆做不出来，求帮助
已经有19人回复
- 连接检测时双酶切总是切不开
已经有9人回复
- 单酶切的大片段连接转化及多个片段的连接转化问题
已经有8人回复
- 双酶切，连接，转化问题
已经有30人回复
- 单酶切，酶连之后验证问题
已经有6人回复
- 酶连之后如何检测？
已经有7人回复
6楼2012-10-13 09:37:06
2楼2012-10-12 17:28:17
3楼2012-10-12 20:32:41
★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
fxj1986: 金币+1, 引物是一样的，正在改变酶切条件 2012-10-13 10:26:32
小丹木木: 金币+3, 光路交流 2012-10-13 16:30:40
小丹木木: 操作失误，不好意思 2012-10-13 16:31:02
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
fxj1986: 金币+1, 引物是一样的，正在改变酶切条件 2012-10-13 10:26:32
小丹木木: 金币+3, 光路交流 2012-10-13 16:30:40
小丹木木: 操作失误，不好意思 2012-10-13 16:31:02
|
有点疑问，也有点小建议： 1. 可以考虑蓝白斑筛选，初步滤掉空载体，白色克隆PCR检测，（这里有个疑问，你PCR验证时说引物自己设计，不知道你这对引物与你之前PCR扩增3K片段时是否一样，如果不一样可以考虑用那对引物扩增来检测一下）。 2. 确定下质粒双酶切体系是否兼容，比如buffer，酶用量等都会有影响。 3. 你的载体自身是否work？ 祝好运。 |
4楼2012-10-13 04:15:23
20