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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 质粒双酶切后回收效率非常低
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骆驼人

金虫 (正式写手)

[交流] 质粒双酶切后回收效率非常低 已有6人参与

400bp目的片段连接在Puc57上，载体大小4-5K，体系为50ul，SpeI和AscI各1ul双酶切，延长酶切时间，回收后浓度只有4ng/ul，同时对表达载体（约10K）酶切回收后的浓度为40ng/ul，目的片段这么低的浓度能够进行连接吗?
如果我把目的片段先扩出来，纯化后再双酶切，这样会不会好一点，只是有一点担心的是片段太小，会不会回收不到？有做过400bp片段PCR后双酶切的吗？
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1楼 2015-04-07 21:57:09
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潇潇杨雨125

银虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
直接PCR产物双酶切，不是减少损失了吗？

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2楼2015-04-08 01:00:36
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2015-04-08 09:32:26
酶切产物切胶回收后测浓度时经常会出现浓度较低的现象，这并不一定是回收率低的问题，有可能是回收时，溶液中残存的琼脂糖干扰吸光值。建议取2微升跑个电泳看看，如能看到回收条带，那做连接应该没问题。即使电泳看不到带，连接一样是有可能成功的。你说的先把片段扩出来，纯化后再双酶切，当然也是可以的，400bp做酶切完全没有问题，关键是你的扩增产物酶切位点两侧是否加了保护碱基，如果没加，会影响酶切效率，甚至可能切不开。
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3楼2015-04-08 02:01:42
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骆驼人

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by stone2239 at 2015-04-08 02:01:42
酶切产物切胶回收后测浓度时经常会出现浓度较低的现象，这并不一定是回收率低的问题，有可能是回收时，溶液中残存的琼脂糖干扰吸光值。建议取2微升跑个电泳看看，如能看到回收条带，那做连接应该没问题。即使电泳看 ...

嗯，谢谢回复，扩增产物两端是加了保护碱基的。那我先连接下试试看，不行的话再扩增后酶切，

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4楼2015-04-08 03:36:40
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骆驼人

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 潇潇杨雨125 at 2015-04-08 01:00:36
直接PCR产物双酶切，不是减少损失了吗？

考虑的是，扩增时残留的酶，buffer等会改变酶切时的buffer，这样就会影响酶切

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5楼2015-04-08 03:41:02
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liu_y

铜虫 (初入文坛)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-04-10 22:31:42
我也遇到过回收产物浓度过低的情况, 这种情况做连接就是碰运气, 连不上的情况居多.
个人感觉nano测定浓度在10ng/ul以上才放心做连接, 实在不行就重做酶切, 加大上样量, 减少洗脱体积, 尽可能浓缩目的片断
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6楼2015-04-08 17:07:10
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李小同

木虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
换个好点的试剂盒咯，我们用qiagen的试剂盒，基本上回收率能达到70%以上
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7楼2015-04-08 17:23:51
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骆驼人

金虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by liu_y at 2015-04-08 17:07:10
我也遇到过回收产物浓度过低的情况, 这种情况做连接就是碰运气, 连不上的情况居多.
个人感觉nano测定浓度在10ng/ul以上才放心做连接, 实在不行就重做酶切, 加大上样量, 减少洗脱体积, 尽可能浓缩目的片断

恩恩，这些都做了，转化后出现了十几个单克隆，应该够的了，菌液PCR后测序看看，
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8楼2015-04-09 20:21:24
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骆驼人

金虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 李小同 at 2015-04-08 17:23:51
换个好点的试剂盒咯，我们用qiagen的试剂盒，基本上回收率能达到70%以上

有这个试剂盒，只是时间久了，不想用它了，嘿嘿
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9楼2015-04-09 20:22:20
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wshi85

木虫 (正式写手)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-04-10 22:32:03
这个载体直接酶切的产物浓度低是没什么问题的，可以直接连载体！
如果你要pcr的话建议选择保真的酶，用通用引物去扩增，纯化后再酶切，回收！
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很久没在虫虫上漂游了，觉得回归虫虫！
10楼2015-04-09 20:56:09
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