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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于一个载体pGZRS-38的XbaI&SacI双酶切的问题
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zhyvyv

木虫 (正式写手)

[求助] 关于一个载体pGZRS-38的XbaI&SacI双酶切的问题

大家好，现遇到这样一个问题：载体pGZRS-38用Fermentas 快速内切酶XbaI&SacI双酶切总是感觉切不开，酶切完后还是有三条带，但中间一条会亮一些，也曾做过分别单酶切，电泳结果类似。也曾对该载体的多克隆位点测序，来自pUC-18，测序结果正确。回收双酶切的中间的亮带，连接后长出的都是些空载菌，而且不知为啥酶切后电泳观察感觉质粒损失很严重，回收的效率非常低。因为XbaI的作用受甲基化影响，所以也购买了全式金去甲基化的E. coli感受态，重新转化质粒，提取质粒，该问题也未得到改善。拜托各位帮我分析一下是什么原因！非常感谢！

pGZRS-38 Xbal&SacI双酶切，Marker为DL5000
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1楼 2012-03-12 10:50:16
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
zhyvyv(金币+1): ★★★很有帮助, 非常感谢 2012-03-13 13:42:04
酶切时减少载体的量。防止载体未切完全，连接时假阳性就多。
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Thank-you，so-blue.
2楼2012-03-12 11:14:58
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echo110609

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

我也遇到双酶切切不开的问题，我用的是kpnI和xbaI,就是切不开，我分别用这两个酶单切，发现XBAI 切不开，我用的是DH5α。楼主你的问题解决了吗？
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3楼2013-05-08 17:06:23
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zhyvyv

木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by echo110609 at 2013-05-08 17:06:23
我也遇到双酶切切不开的问题，我用的是kpnI和xbaI,就是切不开，我分别用这两个酶单切，发现XBAI 切不开，我用的是DH5α。楼主你的问题解决了吗？

XbaI易受甲基化的影响，若是酶切位点甲基化（具体查看此酶的说明书），可能不能切开，我当时换了另一种甲基化缺陷的E. coli，试剂公司有卖，你可试试。
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4楼2013-05-09 10:22:42
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zfj20110603

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by echo110609 at 2013-05-08 17:06:23
我也遇到双酶切切不开的问题，我用的是kpnI和xbaI,就是切不开，我分别用这两个酶单切，发现XBAI 切不开，我用的是DH5α。楼主你的问题解决了吗？

你现在切开了吗？我也是用这两种酶双酶切，但是分别单酶切和双酶切都是两条带，正常情况下单酶切应该是一条带，无比郁闷中。。。
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5楼2013-07-04 10:37:32
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zhyvyv

木虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by zfj20110603 at 2013-07-04 10:37:32
你现在切开了吗？我也是用这两种酶双酶切，但是分别单酶切和双酶切都是两条带，正常情况下单酶切应该是一条带，无比郁闷中。。。...

载体的量少加些，多切几管，或感受态换成甲基化缺陷的大肠杆菌
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6楼2013-07-05 08:52:14
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