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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 双酶切总是切不开。。。有没有人用过NEB的NotI这个酶？
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seven拂晓

新虫 (初入文坛)

[求助] 双酶切总是切不开。。。有没有人用过NEB的NotI这个酶？ 已有10人参与

各位同学
我这两个礼拜一只在用NOtI和sfiI这两个酶双酶切载体，但是一直都切不太出来。为了找出是哪个酶的问题，我是这样做的：
在一号管中加入酶切体系和NOTI酶，37度7个小时，电泳检测，发现酶切后的带和未酶切的带大小相同。说明酶切不成功。
在二号管中加入酶切体系和sfiI酶，50度过夜。电泳检测，酶切后的带比未酶切的带迁移的慢，说明已经成功切开了。

切片段的时候，是在以上同样的条件下（notI酶37度7个小时，再加sfiI酶50度过夜），电泳检测是正确的。
注：这两个酶用的都是NEB的，所用的buffer是一样的，都是一个叫cutsmart的buffer。说明书上写的是notI酶37度酶切15-20分钟，sfiI酶50度酶切15-20分钟。

各位高手知不知道这是怎么回事啊 急求帮助啊 这个NOTI贼贵贼贵的，用不起了！！！！！！！！！！！！
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1楼 2014-06-20 15:09:11
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

554526385

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
seven拂晓: 金币+5 2014-06-20 16:10:05
seven拂晓: 金币+10 2014-06-21 23:39:30
NOtI 的酶切效果受CG methylase导致的DNA甲基化的影响，严重影响
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我存在
4楼2014-06-20 15:50:08
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曾文正公

金虫 (著名写手)
非常讨厌notI这个酶  建议换个酶切位点  用其他酶
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只有非常努力，才能看起来毫不费力
7楼2014-06-20 20:55:42
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曾文正公

金虫 (著名写手)
★
seven拂晓(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-06-22 12:35:43
引用回帖:
23楼: Originally posted by seven拂晓 at 2014-06-21 23:36:02
用的是not1-hf
你的意思是先用not1切，然后pcr回收，再用sfi切？
先用not1还是先用sfi有区别吗...

都可以的  不过建议先用sfiI切  因为你质粒加的很多 而根据你之前的实验 这个酶不太可能有问题  然后再用notI切回收的产物(回收产物的量少)  这样更能消除不确定因素
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只有非常努力，才能看起来毫不费力
26楼2014-06-22 12:09:33
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普通回帖

鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
seven拂晓: 金币+5 2014-06-20 16:11:06
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2014-06-21 00:55:51
seven拂晓: 金币+5 2014-06-21 23:40:08
NOTI酶按理说挺好切的啊，TAKARA的就很好切。你的1ug质粒加了多少酶？试试多加一点切切看。
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2楼2014-06-20 15:30:51
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seven拂晓

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 鬼羽帝魂 at 2014-06-20 15:30:51
NOTI酶按理说挺好切的啊，TAKARA的就很好切。你的1ug质粒加了多少酶？试试多加一点切切看。

我没有测质粒浓度，50ul的体系加了1ul的酶，30ul的质粒，质粒是比较多，可是总得有一部分切开的吧。电泳显示就一条单一的带
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3楼2014-06-20 15:36:43
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seven拂晓

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 554526385 at 2014-06-20 15:50:08
NOtI 的酶切效果受CG methylase导致的DNA甲基化的影响，严重影响

不太懂甲基化，刚才百度了下，还是不太明白，请问质粒也会甲基化吗
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5楼2014-06-20 16:10:51
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2014-06-21 00:56:05
你如果是切空载体，少用点质粒效果好，还有，你判断是否切开的标准貌似不对，容易误判

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6楼2014-06-20 20:08:58
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syx1983

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
分步切试试，not1贵呀，要珍惜。

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8楼2014-06-20 21:21:44
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seven拂晓

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by Neo2000 at 2014-06-20 20:08:58
你如果是切空载体，少用点质粒效果好，还有，你判断是否切开的标准貌似不对，容易误判

那应该以什么标准来判断呢 1ul的酶切多少ul的载体呢
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9楼2014-06-20 21:52:18
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seven拂晓

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 曾文正公 at 2014-06-20 20:55:42
非常讨厌notI这个酶  建议换个酶切位点  用其他酶

这个破载体不是商业化的就两个酶切位点。。。。
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10楼2014-06-20 21:52:50
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