应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 双酶切总是切不开。。。有没有人用过NEB的NotI这个酶？
371/4返回列表1234下一页
查看: 7888  |  回复: 36
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

seven拂晓

新虫 (初入文坛)

[求助] 双酶切总是切不开。。。有没有人用过NEB的NotI这个酶？ 已有10人参与

各位同学
我这两个礼拜一只在用NOtI和sfiI这两个酶双酶切载体，但是一直都切不太出来。为了找出是哪个酶的问题，我是这样做的：
在一号管中加入酶切体系和NOTI酶，37度7个小时，电泳检测，发现酶切后的带和未酶切的带大小相同。说明酶切不成功。
在二号管中加入酶切体系和sfiI酶，50度过夜。电泳检测，酶切后的带比未酶切的带迁移的慢，说明已经成功切开了。

切片段的时候，是在以上同样的条件下（notI酶37度7个小时，再加sfiI酶50度过夜），电泳检测是正确的。
注：这两个酶用的都是NEB的，所用的buffer是一样的，都是一个叫cutsmart的buffer。说明书上写的是notI酶37度酶切15-20分钟，sfiI酶50度酶切15-20分钟。

各位高手知不知道这是怎么回事啊 急求帮助啊 这个NOTI贼贵贼贵的，用不起了！！！！！！！！！！！！
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2014-06-20 15:09:11
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

554526385

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
seven拂晓: 金币+5 2014-06-20 16:10:05
seven拂晓: 金币+10 2014-06-21 23:39:30
NOtI 的酶切效果受CG methylase导致的DNA甲基化的影响，严重影响
赞一下(2人) 回复此楼
我存在
4楼2014-06-20 15:50:08
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

曾文正公

金虫 (著名写手)
非常讨厌notI这个酶  建议换个酶切位点  用其他酶
赞一下(2人) 回复此楼
只有非常努力，才能看起来毫不费力
7楼2014-06-20 20:55:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

曾文正公

金虫 (著名写手)
★
seven拂晓(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-06-22 12:35:43
引用回帖:
23楼: Originally posted by seven拂晓 at 2014-06-21 23:36:02
用的是not1-hf
你的意思是先用not1切，然后pcr回收，再用sfi切？
先用not1还是先用sfi有区别吗...

都可以的  不过建议先用sfiI切  因为你质粒加的很多 而根据你之前的实验 这个酶不太可能有问题  然后再用notI切回收的产物(回收产物的量少)  这样更能消除不确定因素
赞一下(1人) 回复此楼
只有非常努力，才能看起来毫不费力
26楼2014-06-22 12:09:33
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
seven拂晓: 金币+5 2014-06-20 16:11:06
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2014-06-21 00:55:51
seven拂晓: 金币+5 2014-06-21 23:40:08
NOTI酶按理说挺好切的啊，TAKARA的就很好切。你的1ug质粒加了多少酶？试试多加一点切切看。
赞一下 回复此楼
2楼2014-06-20 15:30:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

seven拂晓

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 鬼羽帝魂 at 2014-06-20 15:30:51
NOTI酶按理说挺好切的啊，TAKARA的就很好切。你的1ug质粒加了多少酶？试试多加一点切切看。

我没有测质粒浓度，50ul的体系加了1ul的酶，30ul的质粒，质粒是比较多，可是总得有一部分切开的吧。电泳显示就一条单一的带
赞一下 回复此楼
3楼2014-06-20 15:36:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

seven拂晓

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 554526385 at 2014-06-20 15:50:08
NOtI 的酶切效果受CG methylase导致的DNA甲基化的影响，严重影响

不太懂甲基化，刚才百度了下，还是不太明白，请问质粒也会甲基化吗
赞一下 回复此楼
5楼2014-06-20 16:10:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2014-06-21 00:56:05
你如果是切空载体，少用点质粒效果好，还有，你判断是否切开的标准貌似不对，容易误判

[ 发自小木虫客户端 ]
赞一下 回复此楼
6楼2014-06-20 20:08:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

syx1983

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
分步切试试，not1贵呀，要珍惜。

[ 发自小木虫客户端 ]
赞一下 回复此楼
8楼2014-06-20 21:21:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

seven拂晓

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by Neo2000 at 2014-06-20 20:08:58
你如果是切空载体，少用点质粒效果好，还有，你判断是否切开的标准貌似不对，容易误判

那应该以什么标准来判断呢 1ul的酶切多少ul的载体呢
赞一下 回复此楼
9楼2014-06-20 21:52:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

seven拂晓

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 曾文正公 at 2014-06-20 20:55:42
非常讨厌notI这个酶  建议换个酶切位点  用其他酶

这个破载体不是商业化的就两个酶切位点。。。。
赞一下 回复此楼
10楼2014-06-20 21:52:50
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 seven拂晓 的主题更新
371/4返回列表1234下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 建议基金发布提前给出明确的时间点 +11 kulium 2026-08-21 14/700 2026-08-24 02:12 by 流流伤
[基金申请] 2026国自然函评费到账 +16 羊腰板 2026-08-21 17/850 2026-08-23 23:02 by tianxiaochun
[基金申请] 让我中一个面上吧！ +12 大萍1987 2026-08-20 15/750 2026-08-23 20:44 by 大萍1987
[基金申请] 2026年的国家社科基金项目通讯评审的新规则与新动向、新挑战 +4 process2012 2026-08-23 5/250 2026-08-23 19:58 by jurkat.1640
[基金申请] 什么时候开奖？ +9 CrisMessi 2026-08-18 10/500 2026-08-23 12:03 by 丶昵称占用
[基金申请] 今天放榜吗？ +15 布布和一二 2026-08-19 16/800 2026-08-23 09:55 by 张春生
[基金申请] 93BebMhtakh前后11位开头都是大写 +7 且听虎啸 2026-08-17 8/400 2026-08-22 21:55 by 医学老男孩
[基金申请] filecode，4个jtjc了 +13 ziyangfang 2026-08-19 16/800 2026-08-22 17:08 by WH3796
[基金申请] 人气不行了 +8 fansofjerry 2026-08-21 8/400 2026-08-22 16:30 by zyqchem
[基金申请] 今天基金会出结果吗？20260819 +16 kkkl_v 2026-08-19 17/850 2026-08-22 16:12 by 阿布Abu
[基金申请] 时间戳今天，20号变了 +5 archvillain 2026-08-20 5/250 2026-08-22 06:12 by hui_daxiao
[基金申请] 放榜前的不淡定 40+4 snowwithsea 2026-08-19 14/700 2026-08-21 23:51 by cratir
[基金申请] 看来今天不会放榜了？ +8 chengyan1220 2026-08-21 11/550 2026-08-21 17:52 by dcqxinyang
[基金申请] 时间戳又变了 +13 wuchongjun 2026-08-20 19/950 2026-08-21 17:21 by 紫杉醇
[基金申请] 感觉是下周放榜了 +7 angus9576 2026-08-17 12/600 2026-08-21 13:38 by weiyin
[论文投稿] 投稿咨询 +5 wwm09 2026-08-17 7/350 2026-08-21 10:11 by 期刊论文帮手
[基金申请] 今天放榜没戏了吧 +9 yuleib84 2026-08-19 11/550 2026-08-21 10:06 by gltch
[基金申请] 基金啊基金 +4 longfie172 2026-08-20 4/200 2026-08-21 08:58 by mark mao
[基金申请] 朋友圈看到的 +6 wangzilk 2026-08-18 8/400 2026-08-19 10:55 by Haru815
[基金申请] 明天放榜？ +5 Shxjjxjkx 2026-08-18 5/250 2026-08-18 18:14 by -大大大大大-
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭